Obtención y análisis de imágenes de alta resolución de señales intracelulares de calcio

Abstract

El ión calcio (Ca2+) es usado por prácticamente todos los tipos celulares para señalizar procesos tan diversos como la fertilización, la comunicación neuronal, la contracción muscular o la muerte celular. La versatilidad de este mensajero se basa en la variedad de patrones espacio-temporales que la concentración intracelular de Ca2+ puede desplegar. Dentro de las células el Ca2+ citosólico libre es mantenido a muy baja concentración. Las señales entonces involucran el ingreso de Ca2+ desde el medio extracelular o su liberación desde reservorios internos. Dentro de este ´ultimo tipo de procesos, la liberación desde el retículo endoplasmático (RE) a través de receptores (RIP3s) de inositol 1,4,5-trisfosfato (IP3) juega un rol fundamental. En la mayoría de los casos estos receptores están organizados en cúmulos sobre la membrana del RE y pueden abrirse cuando ligan IP3 y Ca2+. El Ca2+ citosólico tiene un rol dual sobre la cinética de los RIP3s llevándolos a su apertura a concentraciones moderadas y a su inhibición a concentraciones altas. Es por esto que el Ca2+ liberado a través de un RIP3 abierto puede inducir la apertura de canales vecinos. Este fenómeno es conocido como liberación de Ca2+ inducida por Ca2+ (CICR, por su nombre en inglés). En la mayoría de las células los cúmulos de RIP3s están separados por unos pocos micrones. La organización interna de los cúmulos, por otro lado, no es totalmente conocida aunque se supone que puede variar entre situaciones con RIP3s muy empaquetados y otras con mayor separación entre canales. Dado que las características de las señales resultantes dependen del CICR, la distribución espacial de RIP3s intra e inter-cúmulo juega un rol fundamental. Es por esto que la obtención y el análisis de imágenes con resolución suficiente para poder inferir cómo ocurre el acoplamiento entre receptores mediado por calcio es clave. Dependiendo del número de receptores o cúmulos que participan de un mismo evento de liberación, las señales de Ca2+ mediadas por RIP3s permanecen localizadas o se transforman en ondas que viajan entre cúmulos, abarcando, eventualmente toda la célula. Las señales localizadas (elementales) mediadas por RIP3s son llamadas blips o puffs según haya uno o varios RIP3s de un cúmulo simultáneamente abiertos. A través del CICR, los puffs de Ca2+ constituyen los ladrillos fundamentales de las señales más globales. La variedad de las señales que pueden surgir entonces dependen de la inter-relación entre la cinética y arreglo espacial de los canales, el nivel de Ca2+ citosólico, la tasa de liberación de Ca2+ y de los mecanismos que lo atrapan o remueven. El objetivo de la Tesis es develar algunas de las propiedades de estos mecanismos y estudiar cómo se afectan unos a otros. En esta tesis combinamos experimentos, su análisis y el desarrollo de modelos matemáticos para obtener una descripción detallada de los distintos aspectos que moldean el acoplamiento entre eventos de Ca2+ elementales. Esto es particularmente importante dado que el proceso desde señales locales a globales (o spikes) es clave para la determinación de los intervalos de tiempo entre spikes. Se cree que la información está codificada en la frecuencia de estos spikes. Por lo tanto, nuestro objeto de estudio está directamente implicado en la habilidad del Ca2+ de transmitir el mensaje que transporta. Para estudiar señales de Ca2+ mediadas por RIP3s experimentalmente, usamos el ovocito de Xenopus laevis como sistema modelo. Este es un modelo conveniente, entre otras cosas, porque el Ca2+ es liberado desde el RE exclusivamente a través de RIP3s. Los experimentos involucraron la observación de señales de Ca2+ usando diferentes indicadores de Ca2+ fluorescentes (citosólicos y luminal), buffers exógenos e IP3 enjaulado que fue fotoliberado dentro de las células para inducir la apertura de los RIP3s. Para monitorear cambios en la fluorescencia, usamos microscopía confocal multiespectral y microscopía wide-field. Para el modelado usamos descripciones estocásticas y deterministas dependiendo de los aspectos que intentamos describir. En primer lugar investigamos el tamaño de los eventos de Ca2+ observados en ovocitos inmaduros de Xenopus laevis. La distribución de amplitudes de puffs obtenida no fue gaussiana sino que había una notable fracción de eventos de gran tamaño. La distribución de ´áreas de puffs mostraba una cola larga y podía ser ajustada con una relación tipo ley de potencias. Este comportamiento tipo ley de potencias se encontró también dentro de un modelo simple que incluía acoplamiento entre señales individuales para un amplio rango de valores de los parámetros. Un análisis del modelo mostró que una elevación global de la concentración de Ca2+ era muy importante para determinar si la distribución de tamaño de eventos tenía o no cola larga. Esto nos sugirió que la remoción del Ca2+ del citosol es clave para determinar el tipo de señales que podían surgir. Determinamos que cuando el Ca2+ no es removido del citosol a una tasa lo suficientemente alta, la transición del RIP3 de un estado inhibido a un estado activo lleva a una liberación inmediata de Ca2+ y a la propagación de una señal de baja intensidad. Investigamos luego el rol del Ca2+ luminal en las señales. Mientras que el rol del Ca2+ citosólico ha sido ampliamente estudiado, el rol del Ca2+ luminal en las señales de Ca2+ mediadas por RIP3 no ha sido investigado con tanto detalle. Desarrollamos un protocolo original para usar el indicador Fluo-5N AM en ovocitos de Xenopus laevis. Este indicador de Ca2+ había sido usado para sensar Ca2+ luminal en otros tipos celulares pero nunca había sido usado en ovocitos. Combinando el uso del Fluo-5N AM y el de un indicador de Ca2+ citosólico cuya emisión ocurre a una longitud de onda diferente (Rhod-2) seguimos la dinámica del Ca2+ luminal y del Ca2+ citosólico en simultáneo durante las señales. A partir del análisis de estas observaciones, cuantificamos las tasas de liberación y de recaptura del Ca2+ al lumen. Determinamos que la liberación de Ca2+ en el citosol a través de RIP3s abiertos no podía explicar por sí misma la dinámica observada en iii el lumen. Concluimos entonces que existe una fuente virtualmente inagotable de Ca2+ libre luminal que atribuimos a los buffers de Ca2+ luminal que muy rápidamente compensan la depleción de Ca2+ local que la liberación puede eventualmente producir. Esto es diferente al comportamiento observado durante la liberación de Ca2+ desde el retículo sarcoplasmático (RS) en miocitos. Atribuimos esta diferencia a la diferencia entre el cociente entre el ´área y el volumen en ambos tipos celulares. Por lo tanto, concluimos que la geometría no solamente determina la propagación de señales intracelulares de Ca2+ desde el lado citosólico sino también desde su contraparte luminal. Realizamos también experimentos para estudiar y comparar la dinámica espacio-temporal del Ca2+ luminal y citosólico. Para este fin, usamos nuevamente Fluo-5N y Rhod-2 para observar el comportamiento del Ca2+ en ambos reservorios simultáneamente durante una liberación de IP3 prolongada en diferentes regiones. Estos experimentos nos permitieron explorar el acoplamiento entre regiones distantes en cada reservorio. Su análisis sugiere que el Ca2+ citosólico provee el mecanismo de inhibición necesario para terminar las señales. De esta forma, el Ca2+ citosólico parece ser el principal mecanismo de acoplamiento entre RIP3s tanto para la propagación inicial de las señales como para el tiempo que tardan los canales en recuperarse y permitir que pueda generarse una nueva onda global. Para estudiar el acoplamiento entre canales entre clusters distintos, trabajamos finalmente en un set-up alternativo para observar señales de Ca2+ con alta resolución temporal y espacial. A pesar de que el microscopio confocal provee seccionado óptico y alto contraste, el escaneo de la muestra en esta técnica impone una desventaja temporal. Usando un microscopio wide-field, iluminación LED y una cámara EMCCD obtuvimos una resolución axial de aproximadamente 1 micrón. Usamos este set-up para observar señales de Ca2+ mediadas por RIP3s y obtuvimos imágenes 2D con resolución temporal similar a la de las imágenes confocales en modo line-scan (unidimensionales). Este set-up abre la posibilidad de aplicar herramientas de análisis de super-resolución a los puffs de Ca2+ en ovocitos. Este método puede ser usado para detectar señales de Ca2+ en 2D con alta resolución temporal y por lo tanto para estudiar el acoplamiento entre unidades de liberación dentro del cluster o entre clusters distantes.

The calcium ion (Ca2+) is used by virtually all cell types to signal processes as diverse as fertilization, neuronal communication, muscle contraction and cell death. The versatility of this messenger relies on the variety of spatio-temporal patterns that the intracellular Ca2+ concentration can display. Inside cells, free cytosolic Ca2+ is kept at very low concentrations. The signals then involve Ca2+ entry from the extracellular medium or Ca2+ release from internal stores. Among the latter, Ca2+ release from the endoplasmic reticulum (ER) through inositol 1,4,5-trisphosphate (IP3) receptors (RIP3s) plays a major role. These receptors are organized in clusters on the ER membrane and become open upon the binding of IP3 and Ca2+. Cytosolic Ca2+ plays a dual role on IP3Rs leading to their opening at moderate concentrations and to their inhibition at very large ones. Therefore, Ca2+ released through one open IP3R can induce the opening of neighboring ones, a mechanism that is known as Calcium Induced Calcium Release (CICR). In most cell types IP3R-clusters are separated by a few microns. The intra-cluster organization is not fully known, although supposedly it could vary between situations in which IP3Rs are tightly packed and others with larger inter-channel separations. Given that the characteristics of the resulting signals depend on CICR, the IP3R spatial distribution plays a major role. The acquisition of high enough resolution images to infer how the Ca2+-mediated coupling between IP3Rs occurs is thus very important. Depending on the number of receptors or clusters that are involved in a release event, IP3R-mediated Ca2+ signals can remain localized or become waves that propagate between clusters and, eventually, throughout the cell. Local (elementary) IP3R-mediated Ca2+ signals are called blips or puffs based on whether there is only one or several simultaneously open IP3Rs. Ca2+ puffs are the building blocks of global signals via CICR. The variety of signals that can arise in one cell type then depends on the interplay between the kinetics and spatial arrangement of the channels, the cytosolic Ca2+ level, the rate of Ca2+ release and the Ca2+-trapping or removing mechanisms at work. The aim of the Thesis is to unveil some of the properties of these mechanisms and of their interplay. In this Thesis we have combined experiments, their analysis and the development of mathematical models to obtain a detailed description of different aspects that shape the coupling between elementary Ca2+ release events. This is particularly important given that the process from local to global signals (or spikes) is key for the determination of the inter-spike time intervals. It is believed that information is encoded in the frequency of these spikes. Thus, our object of study is directly implicated on the ability of Ca2+ to convey the message it transports. To study IP3R-mediated Ca2+ signals experimentally, we used the Xenopus laevis oocyte as model system. This is an advantageous model, among other things, because Ca2+ is released from the ER exclusively through IP3Rs. The experiments involved the observation of the Ca2+ signals using different fluorescent Ca2+ dyes (both cytosolic and luminal), exogenous buffers and caged-IP3 that was photo-released inside the cells to induce the IP3R openings. To monitor changes in the fluorescence, we used multispectral confocal microscopy and wide-field microscopy. For the modeling we used both stochastic and deterministic descriptions depending on the aspects that we tried to describe. We first investigated the size of Ca2+ release events observed in immature Xenopus laevis oocytes. The puff amplitude distribution obtained was not Gaussian with a noticeable fraction of large size events. The puff area distribution displayed a long tail and could be fitted with a power law relationship. This power law behavior was also encountered within a simple model that included some coupling among individual signals for a wide range of parameter values. An analysis of the model showed that a global elevation of the Ca2+ concentration plays a major role in determining whether the event size distribution is long-tailed or not. This suggested that Ca2+clearing from the cytosol is key to determine the kind of signals that can arise. We determined that when Ca2+ is not removed from the cytosol at a sufficiently high rate, the transition from the inhibited to the active state of an IP3R leads to the immediate release of Ca2+ and to the propagation of a low intensity signal. We then studied the role of luminal Ca2+ on the signals. While the role of cytosolic Ca2+ had been studied at large, the role of luminal Ca2+ on IP3R-mediated Ca2+ signals had not been investigated with that much detail. We developed an original protocol to use Fluo-5N AM in Xenopus laevis oocytes. This Ca2+ dye had been used to monitor luminal Ca2+ in other cell types but had never been used in oocytes. Combining the use of Fluo-5N AM and of a cytosolic Ca2+ dye which fluorescence peaks at a different wavelength (Rhod-2) we monitored the dynamics of luminal and cytosolic Ca2+ simultaneously during signals. From the analysis of these observations we quantified the rates of Ca2+ release and re-uptake in the lumen. We determined that the release of Ca2+ into the cytosol through open IP3Rs could not account by itself for the dynamics observed in the lumen. We then concluded that there is an almost inexhaustible source of free luminal Ca2+ which we attribute to luminal Ca2+ buffers that very fast replenish the local Ca2+ depletion that the release can eventually produce. This is dissimilar to the behavior observed during the release of Ca2+ from the sarcoplasmic reticulum (SR) in myocytes. We attributed this difference to the different volume to area ratio in both cell types. Thus, we then concluded that geometry not only shapes the propagation of intracellular Ca2+ signals from the cytosolic side but also from its luminal counterpart. We also performed experiments to study and compare the spatio-temporal dynamics of luminal and cytosolic Ca2+. To this end, we again used Fluo-5N AM and Rhod-2 to observe the behavior of Ca2+ in both reservoirs simultaneously during sustained IP3 photo-release in different regions. These experiments allowed us to explore the coupling between distant regions in each reservoir. Their analysis suggests that cytosolic Ca2+ provides the inhibitory mechanism needed to terminate the signals. In this way, cytosolic Ca2+ seems to be the main IP3R-coupling mechanism both for the initial propagation of the signals and for the time it takes for the channels to recover and allow a new global wave to be elicited. In order to study the inter-channel coupling at the inter-cluster level, we finally worked on an alternative set-up to observe Ca2+ signals with high temporal and spatial resolution. While the confocal microscope provides optical sectioning and high contrast, the scanning of the sample needed in this technique imposes a temporal disadvantage. Using a wide-field microscope, LED illumination and an EMCCD camera we obtained an axial resolution of approximately 1 micron. We used this set-up to observe IP3R-mediated Ca2+ signals obtaining two-dimensional images of similar temporal resolution as line-scan (e.g., one dimensional) confocal images. The set-up then opens up the possibility of applying super-resolution analyses tools to Ca2+ puffs in oocytes. This method can be used to detect Ca2+ signals in 2D with high temporal resolution and therefore to study coupling between release units within the cluster and between distant clusters.