Aspectos moleculares de producción de manitol por bacterias lácticas heterofementativas

Abstract

El manitol, un azúcar-alcohol con múltiples aplicaciones industriales y en medicina, es producido por ciertas bacterias, hongos, levaduras y plantas. Algunas bacterias lácticas (BL) heterofermentativas son eficientes productoras de manitol, ya que pueden utilizar la fructosa como un aceptor de electrones alternativo y sintetizar manitol por una simple conversión enzimática mediante la enzima manitol deshidrogenasa (MDH), regenerando el NAD(P)+. En esta Tesis Doctoral se identificó y caracterizó el contexto genómico de los genes mdh en Lactobacillus reuteri CRL 1101, L. mucosae CRL 573 y Fructobacillus tropaeoli CRL 2034, tres BL heterofermentativas seleccionadas en nuestro laboratorio por su elevada producción de manitol. En la cepa CRL 2034, se localizaron y caracterizaron además tres genes que codifican para enzimas lactato deshidrogenasa (LDH), dos D-ldh (ldh1 y ldh2) y una L-ldh (ldh3), y se confirmó que esta especie carece de la actividad alcohol deshidrogenasa. Para evaluar la influencia de distintos genes en la biosíntesis de manitol, se generaron mutantes en mdh y en genes relacionados a mdh (gen per; putativa permeasa que forma un operón con mdh) o al balance redox celular (genes ldh). Los genes mdh, per, ldh1, ldh2 y ldh3 de la cepa CRL 2034 fueron mutados por recombinación con plásmidos integrativos construidos con el vector pRV300 (EmR) y un fragmento interno de cada gen, de aproximadamente 400 pb. Las diversas mutantes fueron confirmadas mediante secuenciación de 16S rADN y ensayos Rep-PCR, y la inserción correcta de los plásmidos recombinantes mediante amplificación y secuenciación por PCR. Finalmente, se comparó el crecimiento de CRL 2034 y de las mutantes en el medio FYP (20 % de glucosa y 40 % de fructosa) a pH libre, 30 °C y en condición estática o de agitación (200 r.p.m), y se determinaron los parámetros cinéticos (velocidad máxima de crecimiento y de acidificación), actividad MDH y LDH y producción de manitol. La mutante mdh no presentó actividad MDH, no produjo manitol y requirió de O2 para crecer, confirmando su incapacidad de utilizar fructosa como aceptor de electrones. La cepa ::ldh1 mostró aproximadamente el doble de actividad MDH (7,88 U/mg proteína) que la cepa original (CRL 2034 = 4,72U/mg proteína). El comportamiento de las mutantes ::ldh2, ::ldh3 y ::per fue similar a la de la cepa CRL 2034, no observándose diferencias significativas en sus respuestas a las condiciones evaluadas y en los parámetros determinados. A pesar de los mayores niveles de actividad MDH en la mutante ldh1, su producción de manitol fue similar a la observada en la cepa CRL 2034 a las 48 h, siendo los rendimientos de manitol (YM) de 84 y 88 %, respectivamente. Sin embargo, la producción específica de manitol por unidad formadora de colonia fue mayor en ::ldh1 (1,99 x10-8 mg/UFC) que en CRL 2034 (1,64 x10-8 mg/UFC) demostrando que la mutante es más eficiente para producir manitol, a pesar de su menor crecimiento.