Eficiencia en el uso y adquisición de fósforo en plantas de maíz y soja: participación del óxido nítrico

Abstract

El fósforo (P) es un macronutriente con funciones regulatorias y estructurales, esencial para la transferencia de energía. Bajo condiciones de escasa disponibilidad de este nutriente, las plantas responden ajustando sus caminos metabólicos a fin de reorganizar sus prioridades fisiológicas. Mejorar la adquisición y la utilización de P en cultivos es de gran interés para mantener un buen estado nutricional en las plantas y maximizar la producción de biomasa minimizando la adición de fertilizantes y el consecuente riesgo de eutroficación. El óxido nítrico (NO) participa en la modulación y señalización de un amplio rango de funciones en las plantas, incluyendo las respuestas de aclimatación a estrés biótico y abiótico. Si bien las fuentes de generación del NO en plantas todavía no han sido completamente caracterizadas, es claro que los niveles de esta especie varían en los tejidos de acuerdo a señales fisiológicas y del ambiente, y que también el NO generado en el ambiente puede difundir a los tejidos de las plantas y ejercer efectos biológicos. Con un foco en los niveles de NO como posible componente en la percepción y señalización de las plantas enfrentando deficiencias nutricionales, se avanzó en la caracterización del rol desempeñado por esta especie en algunas respuestas clásicas de las plantas de maíz al déficit de P (Capitulo 4.1) y en los cambios fisiológicos y metabólicos tempranos desencadenados en plantas de soja frente a las primeras horas de restricción de P (Capitulo 4.2). Algunas de las respuestas tempranas a la restricción de P fueron evaluadas comparativamente en soja y maíz teniendo en cuenta sus diferencias metabólicas (metabolismo C3 o C4) (Capitulo 4.3). Las plantas de maíz (Zea mays, híbrido Ax882 Cl-MG) fueron expuestas a cuatro tratamientos que combinaron dos niveles de P (0 y 0,5 mM), y dos niveles de un dador de NO, el S-nitrosoglutatión (GSNO, 0 y 0,1 mM) y se estudiaron a distintos tiempos, 6 y 21 días, las respuestas a la privación de P. Estos tiempos fueron seleccionados teniendo en cuenta que: 1) bajo las condiciones experimentales desarrolladas en este trabajo de tesis luego de 21 días de tratamiento los efectos de la deficiencia de P resultaban claramente observables en las plantas, y 2) trabajos previos que describieron respuestas fisiológicas al déficit de P cuando las plantas presentaban un 20% de restricción del crecimiento, que en nuestro sistema experimental coincidió con el día 6 de tratamiento. Los tratamientos con GSNO sobre las plantas restringidas en P, no afectaron significativamente la acumulación de P, la distribución de biomasa, el contenido de antocianinas y el filocrono, pero provocaron una reducción en la eficiencia de utilización del P (EPU) en la planta entera luego de 21 días de tratamiento. La adición de GSNO a la solución nutritiva ayudó a mantener los valores de clorofila en hojas de plantas expuestas a déficit de P pero no pudo revertir la caída del rendimiento cuántico del fotosistema II (PSII) probablemente debido a la inhibición de mecanismos del proceso fotosintético posteriores a la excitación lumínica de la clorofila, afectados por la baja disponibilidad de P. Luego de 21 días de tratamiento, la actividad de la enzima superóxido dismutasa (SOD) en raíz no se vio afectada significativamente por el déficit de P, sin embargo, la actividad ascorbato peroxidasa (APX) se incrementó durante el mismo. El tratamiento con GSNO incrementó la actividad APX tanto en las plantas control como en las plantas sometidas a déficit de P, mientras que la actividad SOD fue significativamente reducida en ambas condiciones debido al tratamiento. La actividad de las enzimas fosfatasas ácidas en la raíz se incrementó como consecuencia de la restricción de P, y resultó fuertemente influenciada por la presencia del dador de NO, que generó un incremento de la actividad únicamente bajo condiciones de déficit de P. Las plantas de maíz expuestas durante 6 días a restricción de P generaron una fuerte caída en el pH de la solución nutritiva y un incremento en la capacidad de captar P del medio externo. La caída del pH en el medio de cultivo resultó incrementada de forma significativa en presencia del dador de NO, lo cual podría estar relacionado con mecanismos dependientes de esta especie que incrementan la extrusión de protones y/o ácidos orgánicos. El tratamiento con el dador de NO también generó un incremento sobre la capacidad de captación de P desde el medio externo en las plantas provenientes de una situación de déficit del mismo. Futuros estudios permitirán profundizar en torno a los mecanismos moleculares que relacionan al NO con estas respuestas claves de aclimatación a la deficiencia de P. Plantas de soja (Glycinemax, cv Williams 82), fueron sometidas a tratamientos de restricción total de P durante 15, 24 y 48 h. Se utilizó una aproximación Shotgun para evaluar los cambios en el proteoma de manera conjunta con la evaluación de otros procesos fisiológicos. Aunque ni los parámetros fotosintéticos ni el crecimiento fueron significativamente afectados, una caída inicial de la concentración total de P de 27% en las hojas unifoliadas luego de 24 h de restricción del nutriente llevaron a cambios en el proteoma y a modificaciones en los niveles de NO sugiriendo la existencia de cambios metabólicos tempranos inducidos durante las primeras horas de déficit. El análisis proteómico dio como resultado un total de 202 proteínas exclusivamente expresadas y 232 proteínas incrementadas en las hojas de plantas expuestas por 24 h a la restricción de P. La clasificación de las proteínas de acuerdo al consorcio Gene Ontology por su función molecular o procesos biológicos reveló un mayor porcentaje perteneciente a la categoría de actividad catalítica o procesos metabólicos respectivamente. Los resultados sugieren que el metabolismo se prepara en forma temprana para enfrentar restricciones más severas en la disponibilidad de P, con cambios metabólicos que implican el ahorro de ATP y reciclado de P, la provisión de NADPH para procesos biosintéticos, el incremento en enzimas con capacidad antioxidante, del metabolismo de carbohidratos, e involucradas en metabolismo secundario, como por ejemplo en la síntesis de flavonoides, y en la síntesis de hormonas como el etileno. Los cambios metabólicos relacionados al metabolismo de carbohidratos y destinados a mantener el balance redox en la célula parecen ser claves durante las primeras horas de restricción de P. En relación con el metabolismo del NO, tanto los niveles de esta especie como la actividad NR se vieron incrementados en condiciones de restricción de P. Adicionalmente, una isoforma de la NR fue exclusivamente expresada en las hojas de plantas sometidas a restricción de P. Los niveles de NO pueden ser consecuencia del incremento de la actividad NR, aunque otras fuentes de generación de esta especie no pueden ser descartadas. Además, el incremento en la abundancia relativa de proteínas involucradas en la síntesis de etileno sugiere una posible interacción entre el NO y el metabolismo del etileno en hojas de soja pasadas las primeras 24 h de restricción de P. Aunque los niveles de NO se vieron incrementados bajo condiciones de restricción de P, el patrón de nitración de las proteínas no resultó sustancialmente modificado en las hojas, sugiriendo que esta modificación es un proceso especifico y cuidadosamente regulado y cuyo rendimiento se encuentra afectado por multiplicidad de factores. La mayoría de las proteínas nitradas en las hojas de soja presentaron localización cloroplástica, uno de los sitios propuestos de generación de NO y ROS. Sólo una proteína resultó diferencialmente nitrada, la metionina sintasa, siendo el significado funcional de esta modificación in planta blanco de futuros estudios. Así, las plantas de soja parecen percibir la baja disponibilidad de P en forma temprana, y los cambios desencadenados sugieren el ajuste de su metabolismo para afrontar condiciones más severas de restricción al nutriente. La actividad NR y la generación de NO podrían ser mecanismos involucrados en la percepción y respuesta temprana al estrés. En los experimentos comparativos soja-maíz, las plantas crecieron en idénticas condiciones ambientales y fueron sometidas a restricción de P por un período de 24 h. El decaimiento significativo y similar en la concentración de P a tiempos cortos de restricción (24 h) en plantas de maíz y soja (hoja unifoliada en plantas de soja, hoja 2 en plantas de maíz), no impactó en los parámetros fotosintéticos (PSII y concentración de clorofila) ni en otros parámetros fisiológicos como la conductancia estomática, los cuales permanecieron estables para ambas especies. El nivel de NO en las hojas de plantas afectadas por la restricción de P resultó distinto para ambas especies, ya que las hojas unifoliadas de soja (C3), incrementaron significativamente el nivel de NO, mientras que las hojas del maíz (C4) no sólo no lo incrementaron, sino que mostraron una tendencia a disminuir el nivel de esta especie principalmente en la zona de la vaina. Las diferencias observadas para las plantas de maíz y soja coincidieron con los cambios observados en la actividad de la enzima NR permitiendo asumir que el cambio en la concentración de NO se podría deber, al menos en parte, al cambio en la actividad enzimática de la NR. La acumulación de NO en células de la vaina donde la NR está ausente, y en los cloroplastos del mesófilo en las plantas de maíz arroja interrogantes interesantes en torno a la producción de NO en ambos tipos celulares, ya sea que el NO se produzca en las células del mesofilo y se acumule en las células de la vaina o que alguna otra fuente de generación, diferente a la NR, (por ejemplo dependiente de arginina), pueda ser operativa en estas células. De esta manera es posible proponer que la generación de NO también puede estar diferencialmente localizada las hojas de maíz y que las distintas fuentes puedan verse afectadas ante situaciones de estrés, como ha sido observado previamente que ocurre, por ejemplo, con otras enzimas y antioxidantes. Futuros experimentos en torno a la generación y vías de degradación de NO en ambos tipos de células permitirán obtener una panorama más claro de las posibles vías de generación de NO involucradas y la variación en los niveles de NO. Los resultados obtenidos permiten proponer al NO como modulador de respuestas claves de aclimatación frente a la restricción de P. Los cambios tempranos en los niveles de NO sugieren una participación de esta molécula en la percepción de las modificaciones producidas en el ambiente. Si bien los mecanismos involucrados tanto en la generación de esta especie como en la participación de la misma en la modulación de las respuestas necesitan ser investigados, este trabajo de Tesis ha permitido avanzar en el conocimiento de las funciones del NO en las plantas particularmente sometidas a déficit nutricional de fósforo.

Phosphorus (P) is a macronutrient with structural and regulatory functions, essential for energy transfer. Under limited P availability, plant cells respond adjusting their metabolic pathways in order to reorganize physiological priorities. Improving phosphorus (P) acquisition and utilization in crops is of great importance in order to achieve a good plant nutritional state and maximize biomass production while minimizing the addition of fertilizers, and the concomitant risk of eutrophication. Nitric oxide (NO) participates in the modulation and signaling of a wide range of functions in plants, including acclimation responses to biotic and abiotic stress. Endogenous sources of NO remain to be fully characterized, however, it is clear that NO levels vary in plant tissues according to environmental and physiological signals, and that NO generated in the environment can diffuse into plant tissues and exert biological effects. Focusing on NO level as a likely component in sensing and signaling nutritional deficiencies, the role of this molecule in some key responses of maize plants to P deficiency was characterized (Chapter 4.1), and the initial metabolic and physiological changes following P deprivation were estimated in soybean leaves during the first hours of P deprivation (Chapter 4.2). Some early responses to P restriction were evaluated comparatively in soybean and maize plants taking into account metabolic differences (C3 or C4 metabolism) of these species (Chapter 4.3). Maize plants (Zea mays L. Ax882 Cl-MG) were exposed to four treatments performed by the combination of two P levels (0 and 0.5 mM), and two GSNO levels (0 and 0.1 mM), and responses to P-deprivation were studied at 6 and 21 days. The times were selected taking into account: 1) under the experimental conditions employed here after 21 days of treatment P deficiency effects on plants were clearly observed, and 2) previous work observed physiological acclimation responses to P deficiency in plants when growth suffered a 20% restriction in P-deprived relative to P-well supplied plants, in our experimental conditions this situation was coincident with the day 6 of treatment. GSNO treatments on P restricted plants did not affect P accumulation and biomass distribution, anthocyanin content, and filocrono, but a reduction in P utilization efficiency (EPU) was observed in the whole plant after 21 days of treatment. Although chlorophyll content was kept in some leaves after GSNO addition, GSNO treatment could not revert the fall in the quantum yield of photosystem II (PSII), probably due to the inhibition of photosynthetic mechanisms later to light excitation of chlorophyll, that were affected due to the lack of P in the leaves. After 21 days of treatments, superoxide dismutase (SOD) activity was not significantly affected in roots suffering P deficiency; however, ascorbate peroxidase (APX) activity was increased. GSNO treatment also increased APX activity in control and P deprived plants, but SOD activity was significantly decreased in both conditions due to the treatment. Acid phosphatases activity in roots was increased as a consequence of P restriction, and was influenced but the presence of the NO donor, that provoked an increment in the activity just under P restriction. Maize plants exposed for 6 days to P restriction showed a high capacity to perform external medium acidification and P uptake as compared to plants with full nutrition. The ability to decrease the external pH was further increased in those plants that had been grown in the presence of the NO donor. This effect may be related with specific NO-dependent mechanisms leading to proton extrusion and/or a rapid release of organic substances. When the P-uptake ability was evaluated in plants that had been grown simultaneously in the absence of P and in the presence of the NO donor, a higher P-depletion capacity from the external media was observed. Further studies will lead to the understanding about the molecular mechanisms that involve NO with these key acclimation responses to P restriction. Soybean plants (Glycine max, cv Williams 82), were exposed to total P restriction for 15, 24 and 48 h. Shotgun proteomic analyses were employed to evaluate changes in the proteome together with other physiological processes. Although neither growth nor photosynthesis was strongly affected, an initial fall in total P concentration (27%) in the first unifoliate leaves following P deprivation revealed changes in proteome and NO levels, suggesting that metabolic changes were induced during the first hours of P deprivation. Shotgun proteomic analyses of leaves from plants exposed to P-deprivation for 24 h showed a total of 202 proteins exclusively detected and 232 proteins increased in their relative abundance under –P conditions. The proteins affected belong mainly to the catalytic activity or biological processes groups according to Gene Ontology Consortium. Results suggest that metabolism is being prepared to face a deeper decrease in P levels, with metabolic changes leading to: preserve ATP and recycling P, provide NADPH to biosynthetic processes, increase the antioxidant enzyme, and enzymes from carbohydrate metabolism or secondary metabolism, such as related to flavonoid and hormone synthesis (e.g. ethylene). Metabolic changes related to carbohydrate metabolism and to maintain redox balance in the cell seem to be important during the first hours of P deprivation. Higher levels of the bioactive molecule nitric oxide were accompanied with a parallel increase in NR activity under P restriction. Additionally an isoform of NR was exclusively detected in leaves from P restricted plants. Even though the increase in NO level may be a consequence of NR activity, other sources of NO generation could not be discarded. In addition, the increase in the relative abundance of proteins involved in ethylene synthesis, suggests a possible interaction between the NO and ethylene metabolism in soybean leaves during the first 24 hours of P restriction. Despite the increase in NO level under P restriction, the pattern of protein nitration was not substantially modified in the leaves, suggesting that this modification is a tightly regulated and specific process. In fact, biological nitration yield is affected by a multiplicity of processes. The majority of nitrated proteins had a chloroplastic localization in coincidence with a site proposed for NO synthesis and ROS production. Only one protein was differentially nitrated in soybean leaves, the methionine synthase, and the functional significance of this protein modification in planta will require extensive study. Soybean leaves seem to sense low P availability very early and the proteomic changes triggered suggest the adjustment of their metabolism to further P scarcity. NR activity and NO generation may be mechanisms involved in sensing P levels in the cell and triggering early stress responses. In the comparative experiments developed employing soybean and maize plants, both plants were grown under the same conditions and exposed to P restriction treatment for 24 h. The decrease in P concentration in the leaves (first unifoliate soybean leaves, and second leaves in maize plants) did not affect photosynthesis (PSII, and chlorophyll content) and other physiological parameters such as stomatic conductance, that remained stable in both plants. The levels of NO in the leaves were different in soybean (C3) and maize (C4) plants, where the unifoliate soybean leaves showed higher NO level, whereas maize leaves tended to decrease these levels mainly in the zone of bundle sheath cells. These differences were in agreement with the change in the NR activity, suggesting that NR may be one of the ways involved in NO generation. NO accumulation in the zone of bundle sheath cells lead to the question about NO production in both types of maize cells. NO may be produced in mesophyll cells and then accumulated in the bundle sheath cells, or other NO generation sources, different from NR (e.g. arginine dependent) operative in these cells. Thus, it is possible that NO generation could be differentially localized in maize leaves, and that the different sources of NO production may be affected under stress conditions, such as it was previously observed with other antioxidants enzymes. Further experiments related to NO generation and degradation in both types of maize cells will help to clarify the observed NO levels.Overall the results suggest that key acclimation responses to P-restriction are influenced by NO. Early changes in the NO levels suggest a role of this molecule in the sense of environmental changes. Although both, the mechanisms involved in the NO generation, and the contribution of NO in these responses need further research, this work provided an advance regarding the function of this small molecule in plants specially during nutritional stress, such as P-scarcity.