Caracterización fenotípica y molecular de las generaciones segregantes de tres híbridos de segundo ciclo en tomate: validación de QTLs asociados a la calidad de los frutos

Abstract

El tomate es una de las hortalizas de mayor importancia económica mundial. A través del cruzamiento entre el cultivar argentino Caimanta de Solanum lycopersicum y la accesión LA722 de la especie silvestre S. pimpinellifolium mediante un programa de selección divergente-antagónica para el peso y la vida poscosecha de los frutos, se desarrollaron 17 líneas endocriadas recombinantes (RIL). Como resultado del cruzamiento entre RIL es posible obtener los llamados híbridos de segundo ciclo (HSC). En estos HSC es viable encontrar nueva variabilidad genética por recombinación de los genes seleccionados durante la obtención de las RIL progenitoras. El objetivo de la Tesis fue caracterizar fenotípica y molecularmente tres generaciones F2 obtenidas de la autofecundación de tres HSC (RIL18xRIL1, RIL1xRIL8 y RIL1xRIL5), determinar la variabilidad existente en los dos niveles de caracterización, identificar regiones genómicas asociadas a caracteres de calidad de los frutos y seleccionar una generación segregante para iniciar un nuevo programa de mejoramiento. La caracterización molecular de las tres generaciones F2 utilizando seis combinaciones de cebadores de AFLP (Polimorfismo en la Longitud de los Fragmentos Amplificados) originó en todas las poblaciones un número de bandas superior a 100 y un porcentaje de bandas polimórficas superior al 57%, determinando la presencia de una alta variabilidad molecular en todas las poblaciones. En el nivel fenotípico se evaluaron los caracteres del fruto: diámetro, altura, índice de forma, peso, vida poscosecha, firmeza, cociente de absorbancias (a/b), porcentaje de reflectancia (L), pH, sólidos solubles y acidez titulable. La variabilidad generada fue evidenciada dado que, en la mayoría de los casos, se identificaron individuos F2 que tuvieron valores superiores o inferiores a los valores promedios de las RIL. Por otro lado, la aplicación de diferentes herramientas multivariadas permitió conocer, en una primera aproximación integral, las diferentes estructuras de las poblaciones. En el Análisis de Componentes Principales, en las tres generaciones, fueron necesarias las primeras cuatro componentes para explicar cerca del 80% de la variabilidad fenotípica. Analizando la variabilidad molecular con el Análisis de Coordenadas Principales, para obtener el mismo porcentaje de variabilidad, fueron necesarias 12 o más coordenadas. El consenso obtenido entre ambas clases de variabilidad por un Análisis de Procrustes Generalizado fue superior al 64% en todas las F2. La alta asociación entre la información en los niveles fenotípico y molecular encontrada en esta primera aproximación fue profundizada mediante la estimación de diferentes parámetros genéticos y la detección de QTLs (loci de caracteres cuantitativos) por métodos convencionales. Respecto al grado de dominancia, en general, predominó la dominancia completa, aunque también se observó dominancia parcial,sobredominancia y aditividad pura, pero en menor medida. Por otro lado, las tres generaciones presentaron los mayores valores de heredabilidad para los caracteres pH, sólidos solubles y acidez titulable. Se detectó un amplio número de QTLs para la mayoría de los caracteres en las tres generaciones, aunque ninguno de ellos se pudo validar ya que no fueron comunes. La generación F2 del HSC RIL18xRIL1 presentó el mayor número de QTLs detectados y asociados a todos los caracteres; en consecuencia, fue seleccionada para hacer una caracterización molecular más exhaustiva y derivación de familias F3. En relación a la caracterización molecular se llevó a cabo utilizando marcadores de tipo SSR (Repeticiones de Secuencia Simple) y SNP (Polimorfismo de Nucleótido Simple). Por un lado, se utilizaron 12 combinaciones de cebadores de SSR de los cuales el 92% resultaron ser polimórficos. Con estos SSR polimórficos se detectó un total de siete QTLs para peso, vida poscosecha, ambos atributos de color (L y a/b), sólidos solubles y acidez titulable. Dos de ellos (asociados a a/b y a vida poscosecha) pudieron ser validados ya que también fueron identificados en una población retrocruza relacionada. Por otro lado, al disponer de las secuencias de Caimanta y la accesión LA722, se desarrollaron marcadores altamente específicos del tipo SNP. Se utilizaron 130 SNP localizados en los 12 cromosomas de la especie cultivada. De ellos, sólo el 59% segregaron en los individuos de la generación F2, y con ellos se detectaron siete QTLs para diámetro, peso e índice de forma. Se elaboró un mapa físico y genético. Mediante el primero, se pudo estimar que las regiones no segregantes fueron levemente superiores al 50% mientras que el porcentaje de regiones segregantes fue de unos puntos por debajo del 50% (46%). En cuanto al mapa genético, se obtuvieron 23 grupos de ligamiento. En relación al avance a la siguiente generación de autofecundación, aplicando criterios fenotípicos y moleculares se seleccionaron 18 individuos F2 para obtener las familias F3., que fueron caracterizadas fenotípicamente para los mismos atributos que sus progenitores. Se detectaron heredabilidades en sentido estricto significativas para diámetro, altura, índice de forma, peso, pH y acidez titulable. Se concluye que a través de la caracterización fenotípica y molecular con los diferentes tipos de marcadores de ADN utilizados se pudo corroborar que los HSC presentan combinaciones genotípicas favorables entre los genes que fueron seleccionados en generaciones previas. Estas nuevas combinaciones originaron variabilidad genética en el nivel molecular y fenotípico. También fue posible identificar numerosos QTLs mediante los diferentes marcadores moleculares y validar algunos de ellos. Con la información obtenida en estas generaciones tempranas se seleccionaron individuos dentro de la población base seleccionada para obtener familias F3, para iniciar en base a estos resultados un nuevo programa de mejoramiento genético para los caracteres de calidad de fruto.

F2 segregating progeny from the tomato second cycle hybrids (SCH) were obtained from crossing RIL (Recombinant Inbred Lines), which were derived from an interespecific cross between Solanum lycopersicum cv. Caimanta and the accesión LA722 from S. pimpinellifolium. The objectives of this Thesis wwere to characterize three F2 populations by molecular markers and morphological traits in order to evaluate the molecualr and morphological variability, to identify genetics regions associated to quality fruit traits and to select the best population to begin a new breeding program. The phenotypic fruit traits evaluated were: diameter, height, weight, shape index, post-hasrvest life, firmness, abosrbance index, reflectance percentage, pH, soluble solids and titratable acidity. A high molecular diversity was found through six AFLP (Amplified Fragment Lenght Polymorphism). Also a high level of morphological diversity was found using the phenotypic traits. Different multivariate analices were used to asses the degree of concordance among these two approaches. High consensus was found between these methods suggesting that it could be posible to detec QTLs (Quatitative Trait Loci) for these traits. Several QTLs were identified for mosto of the traits. Because of the promissory characteristics of the F2 derived from the SCH RIL18xRIL1, this population was selected to be caharacterized by another DNA markers and to obtain individuals to generate the F3 families. Using 12 primer combinations of SSR (Simple Sequence Repeats), seven QTLs were detected for weight, shelf life, absorbance index, reflectance percentage, soluble solids and titratable acidity. Sequences of both parental of these RIL allowed designing specific SNP (single Nucleotide Polymorphism) markers. Scattered over the 12 chromosomes, 130 SNP were used and seven QTLs were found for diameter, weight and shape index. The physic map obtained showed that the not segregating regions were slightly higher tna 50%, while the percentage of segregating regions was below 50% (45%). The genetic map exhibited 23 linkage groups. Besides, through the phenotypic and molecular data obtained, 18 F2 individuals were selected to generate F3 families. The phenotypic and molecular characterization here obtained has allowed detecting favourable genotypic combinations among the genes that were selected in previous generations. Also, several QTLs were identified. The information obtained in these early generations together with these F3 families indicates that it could be possible to initiate a new breeding program to improve fruit quality traits.