Participación de los neutrófilos en la gestación: efectos moduladores de las células trofoblásticas y el VIP

Abstract

El mantenimiento de la homeostasis inmunológica durante el embarazo requiere múltiples circuitos de regulación a nivel local y sistémico que actúan en forma sincronizada desde el período post-implantatorio hasta el parto. Diversas poblaciones de células inmunes son reclutadas a la interfase materno-placentaria desde el inicio de la gestación y su función es modulada en gran medida por factores solubles y de contacto de las células trofoblásticas. Desde el punto de vista inmunológico, el desarrollo del embarazo normal comprende tres fases caracterizadas por distintos microambientes o perfiles predominantes. Una primera etapa proinflamatoria, asociada a los procesos de implantación y placentación temprana. Esta etapa involucra la ruptura del epitelio uterino, la invasión del endometrio por el blastocisto y la remodelación de los vasos maternos, necesaria para satisfacer la creciente demanda de oxígeno y nutrientes. Esta respuesta inflamatoria inicial está estrictamente controlada para mantener la homeostasis a través de la activación de respuestas antiinflamatorias y tolerogénicas. A continuación, pasadas las 14 semanas, se inicia la segunda fase con un cambio de perfil hacia uno predominantemente antiinflamatorio requerido para el crecimiento fetal. Finalmente, una tercera etapa mucho más corta en duración, se caracteriza por una respuesta proinflamatoria asociada al desencadenamiento del parto.Distintos mediadores solubles como citoquinas, quimioquinas, factores de crecimiento y hormonas regulan estos cambios de perfil, actuando sobre múltiples células blanco entre las cuales los monocitos, macrófagos, células dendríticas y linfocitos T han sido extensamente estudiados. Entre los factores inmunomoduladores de síntesis local, es de particular interés el péptido intestinal vasoactivo (VIP), un péptido pleiotrópico que es sintetizado por células trofoblásticas, entre otras células de la interfase materno-placentaria.El objetivo de la presente tesis es investigar mecanismos celulares y moleculares que condicionan el fenotipo de los neutrófilos y su interacción con células trofoblásticas con especial foco en la participación del sistema VIP y sus receptores VPAC.Para abordar este objetivo se emplearon dos diseños principales, por un lado diseños in vitro con células humanas utilizando neutrófilos y monocitos de dadores sanos y líneas celulares derivadas de trofoblasto humano de primer trimestre (Swan-71 y HTR8-SVneo). Por otro lado, para profundizar en los efectos de VIP y sus receptores, se emplearon dos cepas de ratón genéticamente modificadas que no expresan los receptores VPAC1 o VPAC2 de dicho péptido.En primer lugar, demostramos que los neutrófilos humanos expresan ARN mensajero de los dos receptores VPAC1 y VPAC2. Observamos que el VIP y los medios condicionados de células trofoblásticas (MC) inhiben la formación de trampas extracelulares de neutrófilos (NETs) inducidas por el forbol miristato acetato (PMA), con disminución en la liberación de ADN y elastasa. Esta disminución en la NETosis es acompañada por un aumento de la apoptosis. Más aún, vimos que el VIP y los MC inhiben la liberación de mieloperoxidasa inducida por PMA. Hallamos que el VIP y los MC de las dos líneas trofoblásticas Swan-71 y HTR8 disminuyen la formación de especies reactivas de oxígeno (ROS) inducida por el PMA. A su vez, los efectos inhibitorios de liberación de ROS y ADN fueron prevenidos por un antagonista de receptores de VIP. Demostramos que tanto el VIP como los MC inhiben parcialmente la autofagia inducida por PMA. Por otra parte, el VIP y los MC aceleran la apoptosis espontánea de neutrófilos y revierten el efecto antiapoptótico del LPS. En cuanto al papel del VIP trofoblástico, observamos que los MC de células trofoblásticas deficientes en VIP no inducen el efecto proapoptótico sobre los neutrófilos. Asimismo, se observó una mayor fagocitosis de neutrófilos apoptóticos por monocitos cuando los primeros habían sido cultivados con MC, comparado con aquellos incubados en RPMI.En la segunda parte de la tesis, estudiando las cepas deficientes en los receptores VPAC1 y VPAC2, encontramos que las cruzas VPAC1 KO x VPAC1 KO tienen una menor cantidad de crías al nacer, y la cruza VPAC2 KO x VPAC2 KO presenta la misma tendencia. También vimos en ambas cepas una asimetría marcada en la distribución de los sitios a lo largo del útero. Estos sitios presentan una menor expresión del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) en ambas cruzas y las células trofoblásticas gigantes aisladas de los sitios tienen expresión alterada de factores relacionados con la angiogénesis: VEGF, angiopoyetina 1 y metaloproteinasa 9. Los sitios de implantación también presentan una alteración en factores relacionados a la regulación de la respuesta inmune como la proteína quimioatrayente de monocitos 1, el marcador F4/80 y el factor plaquetario 4. Finalmente, al aislar neutrófilos de hembras VPAC1 y VPAC2 knock out preñadas observamos que tienen alterada su tasa de apoptosis y su capacidad de modular estímulos activadores como el PMA. Los macrófagos también presentan diferencias en su perfil. Concluimos que factores liberados por las células trofoblásticas inhiben la activación de los neutrófilos y promueven su apoptosis. Los resultados indican que, entre dichos factores, el VIP liberado por las células trofoblásticas tiene un papel relevante y que otros factores producidos por estas células a través de mecanismos mediados por el VIP endógeno, también contribuyen a la desactivación.

Homeostasis maintenance during pregnancy requires multiple regulation circuits that act in a synchronized way at both local and systemic levels from the post-implantatory period until delivery. Different immune cell populations are recruited to the maternal-placental interface from the beginning of gestation and their function is regulated by trophoblast cells through contact and soluble factors. From an immunological point of view, normal pregnancy involves three immune stages characterized by different microenvironments or predominant cell profiles. A first pro-inflammatory stage, associated with the implantation process and early placentation. This process involves rupture of the epithelial lining, endometrial invasion and remodeling of maternal vessels that will support the new oxygen and nutrients demand. This initial inflammatory response is strictly controlled to maintain homeostasis through activation of anti-inflammatory and tolerogenic responses. Then, after 14 weeks of pregnancy, the second stage initiates with a profile switch towards an anti-inflammatory one, required for fetal growth. Finally, there is a short stage associated with labor, characterized by a pro-inflammatory response. Different soluble mediators such as cytokines, chemokines, growth factors and hormones modulate the mentioned profile changes, acting on multiple target cells; some of which have been extensively studied like monocytes, macrophages, dendritic cells and T cells. The aim of this thesis is to investigate cellular and molecular mechanisms that condition the phenotype of neutrophils and their interaction with trophoblast cells with special focus on VIP and its receptors VPAC. To address this objective, two models were used. On the one hand, in vitro models with human cells using neutrophils and monocytes from healthy donors and trophoblast cell lines (Swan-71 and HTR8-SVneo). On the other hand, in order to deepen VIP’s effects and its receptors, two mice strains that do not express the receptors VPAC1 or VPAC2 were used. Firstly, we found that neutrophils express messenger RNA of the two receptors VPAC1 and VPAC2. We observed that VIP and conditioned media from trophoblast cells (CM) inhibit phorbol myristate acetate (PMA)-induced neutrophil extracellular traps (NETs) formation, with a diminished release of DNA and elastase. This diminished NETosis is accompanied by an increase in neutrophil apoptosis rate. Moreover, we found that VIP and CM impair PMA-induced myeloperoxidase release. We demonstrated that VIP and CM of the two trophoblast cell lines Swan-71 and HTR8 inhibit reactive oxygen species formation (ROS) induced by PMA. Even more, the inhibitory effects in ROS formation and DNA were prevented when a VIP receptor antagonist was used. We demonstrated that both VIP and CM partially inhibit PMA-induced autophagy in neutrophils. Furthermore, we found that VIP and CM accelerate spontaneous neutrophil apoptosis and reverse the anti-apoptotic effect of LPS. As for the role of trophoblast VIP, we observed that conditioned media from VIP-deficient trophoblast cells fail to induce neutrophil apoptosis. Likewise, we found a higher phagocytosis rate of apoptotic neutrophils when they had been previously incubated with CM, compared to those incubated in RPMI alone. In the second part of the thesis, when we studied VPAC1 and VPAC2 deficient mice strains, we found that VPAC1 KO x VPAC1 KO mating have fewer pups and VPAC2 KO x VPAC2 KO mating presents the same tendency. We also observed a marked asymmetry in the sites distribution along the uterine horns. Moreover, implantation sites from both strains present a lower expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) and isolated trophoblast giant cells from these sites also have an altered expression in angiogenesis related factors such as VEGF, angiopoietin 1 and metalloproteinase 9. Implantation sites also present alteration in different parameters related to immune regulation like monocyte chemoattractant protein-1, F4/80 marker and platelet factor 4. Finally, when we isolated neutrophils from VPAC1 and VPAC2 pregnant mice, we found that they have an altered apoptosis rate and ability to modulate activating stimulus like PMA. Macrophages also present differences in their profile. We conclude that factors released by trophoblast cells inhibit activation of neutrophils and promote their apoptosis. Results indicate that, amongst these factors, VIP released by trophoblast cells has a relevant role and that other factors produced by these cells also contribute to neutrophil deactivation, through mechanisms mediated by endogenous VIP.