Relevancia de la Acetiltransferasa de Histonas Myst4 sobre el mantenimiento de la pluripotencia y la diferenciación de Células Madre Embrionarias

Abstract

La pluripotencia y autorrenovación, propiedades fundamentales de las células madre embrionarias (CME), son mantenidas por factores de transcripción (FT) específicos, siendo los más importantes Oct4, Sox2 y Nanog. Estos factores ocupan al mismo tiempo las regiones promotoras de diversos genes a lo largo de todo el genoma, actuando como el núcleo de una red regulatoria que modula la expresión de genes de pluripotencia y de diferenciación celular. Esta regulación de la transcripción está relacionada con cambios en la estructura de la cromatina, generados por distintas proteínas remodeladoras que modifican las colas de las histonas o el DNA, mediante metilación, acetilación, fosforilación, ubiquitinación, etc. Estas enzimas mantienen la cromatina del estado pluripotente y realizan las modificaciones epigenéticas necesarias para comenzar la diferenciación de células madre pluripotentes (CMP). Se ha reportado que la acetiltransferasa de histonas Myst4 posee en su región promotora un elemento regulatorio altamente ocupado por estos FT en CME de ratón. Nuestra hipótesis postula que FT clave de células madre regulan la expresión de Myst4, y que esta expresión es necesaria para el mantenimiento de las propiedades fundamentales de CME. Para estudiarla, nos propusimos como primer objetivo analizar la unión de los FT en la región promotora de Myst4 mediante estudios de inmunoprecipitación de la cromatina (ChIP-seq) disponibles en bases de datos. Luego, analizamos el patrón de expresión de Myst4 en CME de ratón indiferenciadas y en diferentes etapas de distintos protocolos de diferenciación, tanto en ensayos generados en nuestro laboratorio como en datos de diferenciaciones disponibles de forma abierta. Posteriormente, estudiamos la regulación de Myst4 por los FT esenciales mediante un abordaje de silenciamiento de estos factores en CME. En este trabajo de tesis, observamos que Myst4 se expresa en CME de ratón y que es reprimido durante la diferenciación hacia cualquier tipo celular. Además, nuestros resultados sugieren que su expresión podría estar regulada por Nanog y Oct4, tanto por su posicionamiento en la región regulatoria de Myst4 como por su represión cuando cualquiera de estos dos factores es silenciado. Para estudiar la relevancia de Myst4 sobre el mantenimiento de las propiedades de células madre, utilizamos en primer lugar la estrategia de silenciamiento por shRNA. Sin embargo, ninguno de los tres shRNA ensayados logró un silenciamiento consistente en la expresión de este remodelador. Posteriormente, decidimos utilizar la estrategia de CRISPR/Cas9 para generar líneas celulares de CME knockout para Myst4 (W4 M4-/-). Esta línea no presentó diferencias significativas con respecto a la línea wild type en los niveles de marcadores de pluripotencia y diferenciación temprana. Sin embargo, observamos un cambio en la morfología de las colonias formadas por las células en estado indiferenciado, siendo las mutantes menos refringentes y más planas que las wild type. Por otro lado, las células W4 M4-/- mostraron un mayor número de células cuando se diferenciaron hacia progenitores neurales. Además, este aumento se vió acompañado por una disminución del marcador de progenitor neural Sox1 y el aumento del marcador de mesodermo Brachyury. Estos resultados sugieren que la línea con ausencia de Myst4 presenta una disminución en la eficiencia de diferenciación neural. Los resultados encontrados en este trabajo de tesis sugieren que Myst4 cumple una función en la diferenciación de CME. Nos encontramos analizando la relevancia de Myst4 en la proliferación y la apoptosis de CME en la diferenciación hacia progenitores neurales y neuronas. Consideramos que entender los procesos involucrados en la regulación de la estructura de la cromatina en CME es fundamental para su futura aplicación

Pluripotency and self-renewal, fundamental properties of embryonic stem cells (ESC), are maintained by specific transcription factors (TF), the most important being Oct4, Sox2 and Nanog. These factors occupy at the same time the promoter regions of diverse genes throughout the genome, acting as the nucleus of a regulatory network that modulates the expression of pluripotency and cell differentiation genes. This regulation of transcription is related to changes in the structure of chromatin, generated by different remodeling proteins that modify the tails of histones or DNA, by methylation, acetylation, phosphorylation, ubiquitination, etc. These enzymes maintain the chromatin of the pluripotent state and perform the epigenetic modifications necessary to begin the differentiation of pluripotent stem cells (CMP). It has been reported that histone acetyltransferase Myst4 possesses in its promoter region a regulatory element highly occupied by these TFs in mouse ESC. Our hypothesis postulates that the key stem cells TF regulate the expression of Myst4, and that this expression is necessary for the maintenance of the fundamental properties of ESC. To study it, we proposed, as a first objective, to analyze the binding of the TF in the promoter region of Myst4 through chromatin immunoprecipitation studies (ChIP-seq) available in databases. Then, we analyzed the expression pattern of Myst4 in undifferentiated mouse ESC and in different stages of different differentiation protocols, both in assays generated in our laboratory and in open databases. Subsequently, we studied the regulation of Myst4 by the essential TF by means of a silencing approach of these factors in ESC. In this thesis work, we observed that Myst4 is expressed in mouse ESC and that it is repressed during differentiation towards any cell type. In addition, our results suggest that its expression could be regulated by Nanog and Oct4, both by its positioning in the regulatory region of Myst4 and by its repression when any of these two factors is silenced. To study the relevance of Myst4 on the maintenance of stem cell properties, we first used a silencing strategy by shRNA. However, none of the three shRNA tested achieved consistent silencing of the expression of this remodeler. Subsequently, we decided to use the CRISPR/Cas9 strategy to generate ESC knockout cell lines for Myst4 (W4 M4 -/-). This line did not show significant differences to the wild type line with respect to levels of pluripotency and early differentiation markers. However, we observed a change in the morphology of the colonies formed by the cells in the undifferentiated state, the mutants being less refractile and flatter than the wild type. On the other hand, W4 M4 -/- cells showed a greater number of cells when they differentiated towards neural progenitors. In addition, this increase was accompanied by a decrease in the neural progenitor marker Sox1 and the increase in the mesoderm marker Brachyury. These results suggest that the line with absence of Myst4 shows a decrease in the efficiency of neural differentiation. The results found in this thesis suggest that Myst4 plays a role in the differentiation of ESC. We are analyzing the relevance of Myst4 in the proliferation and apoptosis of ESC in the differentiation towards neural progenitors and neurons. We believe that understanding the processes involved in regulating the structure of chromatin in ESC is fundamental for its future application.