Participación de las vías de señalización celular dependientes de proteínas quinasas activadas por mitógenos Raf/MEK/ERK y p38 en la multiplicación del virus Junín

Abstract

El virus Junín (JUNV), miembro de la familia Arenaviridae, es el agente causal de la fiebre hemorrágica argentina, enfermedad endemo-epidémica que afecta una amplia zona central de la República Argentina y para la cual, si bien existe una vacuna atenuada eficaz, no hay disponible un tratamiento antiviral específico.Numerosos virus modulan diferentes vías de señalización celular entre las que se encuentran aquellas mediadas por las proteínas quinasas activadas por mitógenos (MAP quinasas), proteínas implicadas en la proliferación, supervivencia, diferenciación y apoptosis celular.El presente trabajo de tesis tuvo como objetivos analizar el estado de activación de las vías dependientes de MAP quinasas Raf/MEK/ERK y p38 en la infección de JUNV en cultivos celulares, establecer la importancia de estas vías para la infección y determinar el rol que cumple la vía Raf/MEK/ERK en diferentes etapas del ciclo de multiplicación viral.Se demostró que la infección con JUNV induce la activación de Raf/MEK/ERK en diferentes líneas celulares, mientras que la activación de p38 es dependiente del sistema celular analizado. Se comprobó que en cultivos de células Vero la activación de Raf/MEK/ERK es de tipo bifásica, observándose una primera activación temprana y una segunda fase de activación a las 7 h pos-infección, mientras que la fosforilación de p38 se hace evidente fundamentalmente a tiempos tardíos de la infección. El bloqueo de las vías mediante inhibidores químicos o RNAs de interferencia demostró que ambas rutas de señalización promueven la multiplicación de JUNV. La producción de virus infeccioso y la expresión de proteínas virales se redujeron de manera notoria en presencia de inhibidores específicos de cada una de las cascadas de señalización, tanto en células de mono como en líneas celulares humanas. El análisis detallado del papel de la vía Raf/MEK/ERK en diferentes etapas del ciclo de multiplicación de JUNV mostró que esta ruta de señalización no estaría implicada en las etapas iniciales de la infección como la adsorción, la internalización o el desnudamiento viral sino en la síntesis de RNA viral. Esto último se puso en evidencia mediante la cuantificación de los niveles de RNA viral en cultivos celulares tratados con U0126, inhibidor específico de la vía. Estos hallazgos se corroboraron empleando un sistema de genética reversa basado en análogos del genoma del arenavirus Tacaribe, virus estrechamente emparentado con JUNV. Se determinó además que la inhibición de la vía no afectaría la traducción de proteínas virales, por lo cual la reducción de la expresión de proteínas virales detectada en los cultivos celulares tratados con U0126 sería consecuencia de la inhibición de la síntesis de RNA viral. El tratamiento con el inhibidor de la vía Raf/MEK/ERK tampoco afectó los niveles de fosforilación del factor eIF2α, componente celular clave en el proceso de traducción.Los resultados obtenidos en este trabajo muestran por primera vez la capacidad de JUNV de activar vías de señalización celular dependientes de MAP quinasas y ponen en evidencia que las mismas son relevantes en la multiplicación de este virus. Asimismo, cabe destacar que la comprensión del papel de las rutas de transducción de señales en la replicación y patogénesis viral tiene importantes implicancias en el desarrollo de nuevas terapias antivirales, dado que la modulación de estas vías podría constituir una estrategia terapéutica con bajo riesgo de aparición de resistencia viral y efectiva frente a diferentes virus que manipulen de manera similar estos mecanismos de señalización.

Junín virus (JUNV), a member of the Arenaviridae family, is the causative agent of Argentine hemorrhagic fever (AHF), an endemo-epidemic disease that affects a large central area of Argentina. Although an effective attenuated vaccine against AHF has been developed, no specific antiviral treatment is available. Numerous viruses can modulate cell signal transduction cascades, such as mitogen-activated protein kinase (MAPK)-dependent signaling pathways, which are involved in cellular proliferation, survival, differentiation and apoptosis. The aims of this thesis were the analysis of the activation state and the importance of Raf/MEK/ERK and p38 signaling cascades during JUNV infection in cell cultures as well as the study of the role that Raf/MEK/ERK pathway plays in different stages of JUNV multiplication cycle. It was demonstrated that JUNV infection induces the activation of Raf/MEK/ERK pathway in different cell lines whereas the activation of p38 is dependent on the cell system assayed. The activation of Raf/MEK/ERK route in Vero cells was biphasic, with a first early activation and a second phase of activation at 7 h pos-infection, while the activation of p38 occurs mainly during late stages of infection. Pathway blockade by chemical inhibitors or RNA interference showed that both signaling cascades are necessary for JUNV multiplication. In the presence of specific inhibitors of each signaling cascade, infectious virus production and viral protein expression are markedly reduced in both monkey and human cell lines. The detailed analysis of the role of Raf /MEK /ERK pathway in different stages of JUNV multiplication cycle showed that this signaling route would not be involved in the initial stages of the infection, such as adsorption, internalization or viral uncoating, but in the synthesis of viral RNA. The latter was proved by measuring viral RNA levels in cell cultures treated with U0126, a specific inhibitor of the pathway. These findings were corroborated using a reverse genetic system based on genome analogues of Tacaribe virus, an arenavirus closely related to JUNV. It was further determined that the inhibition of Raf /MEK /ERK pathway would not affect viral translation indicating that the reduction in viral protein expression detected in cultures treated with U0126 would be a consequence of viral RNA synthesis inhibition. Furthermore, U0126 treatment did not affect the levels of phosphorylation of eIF2α, a key cellular factor involved in the translation process. The results obtained in this work show for the first time the ability of JUNV to activate MAPK-dependent cell signaling cascades and reveal that these transduction pathways are relevant for JUNV multiplication. Likewise, it is important to emphasize that the understanding of the role of signal transduction pathways in viral replication and pathogenesis has important implications in the development of new antiviral treatments, given that the modulation of these cascades could constitute a therapeutic strategy with low risk of viral resistance emergence and effective against different viruses that manipulate those cell signaling mechanisms in a similar fashion.