Determinantes moleculares de la interacción droga-proteína: uso de cosolventes como moléculas de prueba

Abstract

Uno de los procesos biológicos más importantes a nivel molecular es la formación de complejos proteína-ligando. Determinar la estructura de estos sistemas y las interacciones clave subyacentes resulta no sólo relevante per se, sino que posee aplicaciones directas en los esquemas de descubrimiento de fármacos. En este contexto, las simulaciones de dinámica molecular en presencia de solventes mixtos pueden utilizarse para estudiar sitios activos o de unión en proteínas. Los solventes mixtos consisten en mezclas acuosas de pequeñas moléculas orgánicas (cosolventes) con grupos funcionales que reproducen distintos tipos de interacciones moleculares específicas observadas en ligandos de mayor tamaño. De este modo, y gracias a su competencia con las moléculas de agua para unirse a la superficie proteica, los cosolventes actúan como sondas o moléculas de prueba que resultan útiles para revelar sitios de interacción proteína-ligando importantes (hot spots).En el presente trabajo de tesis realizamos simulaciones de dinámica molecular de 18 proteínas diferentes usando como solvente mezclas acuosas de etanol, acetamida, acetonitrilo y acetato de metilamonio, además de agua pura. Para cada sistema se determinaron los sitios de solvente correspondientes, definidos como regiones del espacio adyacentes a la superficie proteica donde la probabilidad de hallar un átomo de prueba de solvente es mayor que la de encontrarlo en el seno del solvente. Se realizó entonces una comparación sistemática entre los sitios identificados para las diferentes moléculas de prueba y 121 complejos proteína-ligando con estructura conocida. Se analizó estadísticamente la capacidad de los diferentes sitios de solvente para revelar las interacciones proteína-ligando de estos complejos, especialmente aquellas que resultan determinantes para la unión y constituyen el farmacóforo derivado de ligando. La sensibilidad obtenida para los sitios de agua y la especificidad y precisión de la sonda de etanol resultaron puntos salientes de este análisis.Por otro lado, los sitios de solvente fueron caracterizados termodinámicamente. Dicha información, especialmente la ocupancia (energía libre de unión) y la dispersión (entropía traslacional) de los sitios, fue traducida para generar puntos farmacofóricos derivados de los cosolventes. La especificidad mostrada por el etanol para reproducir interacciones proteína-ligando lo posiciona como una excelente sonda para usar como sesgo farmacofórico en experimentos de docking. Por ende, se aplicó el sesgo derivado de los sitios de etanol para la predicción estructural de complejos proteína-ligando y la evaluación retrospectiva del desempeño en campañas de screening virtual de inhibidores. El método sesgado mostró éxito en la predicción del modo de unión de ligandos, tanto en experimentos de self docking como de cross docking, y se lograron incrementos significativos en el enriquecimiento de ligandos activos según su afinidad relativa al evaluar el desempeño en screening virtual.Finalmente, se obtuvieron estimaciones de energía libre de unión de complejos proteína-ligando con estructura conocida sumando las contribuciones de energía libre de los sitios de solvente que son reemplazados por grupos de ligando capaces de establecer el mismo tipo de interacciones. Las correlaciones entre la energía libre de unión predicha y experimental resultaron altas y, de modo más amplio, se lograron discriminar exitosamente ligandos similares según la afinidad relativa predicha.En conclusión, el trabajo de tesis presenta un método desarrollado y validado que permite aplicar de modo directo y simple la técnica de dinámica molecular en solventes mixtos como herramienta para el descubrimiento de drogas basado en estructura.

One of the most important biological processes at the molecular level is the formation of protein−ligand complexes. Determining the structure of these systems and the underlying key interactions is of paramount relevance and has direct applications in drug discovery schemes. In this context, molecular dynamics simulations in mixed solvents may be used to study protein active/binding sites. Mixed solvents are aqueous mixtures of small organic molecules (cosolvents) bearing functional groups that reproduce different types of specific molecular interactions observed on common ligands. Thus, and due to the competition with water molecules for binding to the protein surface, cosolvents act as probe molecules useful to reveal important proteinligand interaction sites (hot spots). In the current thesis, we have performed molecular dynamics simulations of 18 different proteins in pure water as well as water mixtures of ethanol, acetamide, acetonitrile and methylammonium acetate. For each system, we determined the corresponding solvent sites, defined as space regions adjacent to the protein surface where the probability of finding a probe atom is higher than that in the bulk solvent. Then, we systematically compared the identified solvent sites for each probe with 121 different protein−ligand complexes with known structure. A statistical analysis was made for the solvent sites capacity to reveal protein-ligand interactions from these complexes, especially those that are crucial for the binding and define the ligand-based pharmacophore. The sensitivity obtained for water sites and the specificity and precision of ethanol probe are remarkable results of this analysis. On the other hand, the solvent sites were thermodynamically characterized. Such information, especially the occupancy (free energy of binding) and dispersion (translational entropy) of the sites, was translated to generate cosolvent-based pharmacophoric points. The specificity shown by ethanol to reproduce protein-ligand interactions makes it a great probe to use as a pharmacophoric bias in docking experiments. Therefore, the bias derived from ethanol sites was applied for the structural prediction of protein-ligand complexes and the retrospective evaluation of virtual screening campaigns. The biased method showed success in ligand binding mode prediction, both in self docking and cross docking experiments, and significant increases in ligand enrichments were observed in the virtual screening assessments. Finally, free energy of binding estimations were obtained for protein-ligand complexes with known structure by adding the free energy contribution of solvent sites that are replaced by ligand groups capable of establishing the same type of interactions. The correlations between predicted and experimental free energy of binding turned out to be high and, in general, successful discrimination between similar ligands were attained based on their relative predicted affinity. In conclusion, the current thesis present a validated method that allows the direct and simple application of molecular dynamics in mixed solvents as a tool for structure based drug discovery.