Estudio biofísico del mecanismo de acción del receptor de glucocorticoides

Abstract

El núcleo celular es una organela con una organización espacial muy compleja. Los componentes responsables de las distintas funciones nucleares, como la replicación y la reparación del ADN, la transcripción y el procesamiento del ARN, no se encuentran distribuidos homogéneamente en el espacio nuclear sino compartimentalizados en diferentes dominios subnucleares, definidos por ácidos nucleicos y/o proteínas.En este trabajo de Tesis, se propuso estudiar la organización dinámica de un factor de transcripción en el núcleo, utilizando como modelo el receptor de glucocorticoides (GR), un factor de transcripción activado por ligando. El uso clínico de glucocorticoides otorga una especial relevancia al estudio del mecanismo de acción del receptor, en el marco de la búsqueda de ligandos que conserven los efectos deseados de los glucocorticoides (anti-inflamatorios e inmunosupresores) pero minimicen sus efectos adversos (metabólicos).Mediante el uso de microscopía confocal y de técnicas basadas en espectroscopía de correlación de fluorescencia (FCS) se exploró la distribución espacial subnuclear del GR y su dinámica intranuclear en células vivas en cultivo, con el fin de establecer ciertas correlaciones entre estos aspectos y la actividad transcripcional del GR.Los resultados muestran que, en células no estimuladas, el GR inactivo se encuentra principalmente en el citoplasma, mientras que NCoA-2 ?un importante coactivador de receptores nucleares? se acumula en dominios focales nucleares identificados como cuerpos de leucemia promielocítica (PML). La unión al GR de un agonista como dexametasona (Dex) promueve una redistribución espacial de ambas proteínas, que pasan a colocalizar e interactuar en múltiples foci subnucleares. Se demostró además que estos foci son estructuras dinámicas dependientes de la integridad del ADN y presentan un recambio rápido (~1 s) de sus componentes con el nucleoplasma.Por otra parte, se demostró que el receptor y el coactivador difunden dentro del núcleo y pueden interactuar con sitios de distinta especificidad en la cromatina, caracterizados por tiempos de interacción de ~500 y ~50 ms (denominados sitios lentos y rápidos, respectivamente). Una dinámica similar se detectó al estudiar la interacción del GR con un arreglo de múltiples copias de un promotor conteniendo secuencias blanco del GR, introducido en el genoma de una línea celular. La activación con Dex produce un aumento tanto del tiempo de residencia como de la unión de GR a los sitios lentos en el ADN. Esta unión puede ser favorecida además por la sobreexpresión de NCoA-2. De manera simétrica, la activación del GR promueve la unión al coactivador y el reclutamiento de éste a los sitios lentos.Con el objetivo de correlacionar la funcionalidad del receptor con la distribución espacial y la dinámica que presenta en el núcleo, se utilizaron mutantes del GR y ligandos que al unirse al receptor producen variantes conformacionales con actividad transcripcional deficiente. En algunos casos, se observó que la incapacidad transcripcional se ve acompañada por una dinámica y una distribución intranucleares diferentes y, especialmente, una deficiencia en la capacidad de interactuar con NCoA-2.En conclusión, la partición dinámica de un factor de transcripción en diferentes reservorios nucleares constituye un mecanismo regulatorio que impactaría en su función biológica. El enfoque clásico del factor de transcripción interactuando in vitro con su secuencia blanco implica no tener en cuenta todas las interacciones que ocurren en el núcleo de células vivas. El conjunto de estas interacciones define la disponibilidad local del factor de transcripción y, en última instancia, las posibilidades de interactuar con secuencias blanco y regular la expresión génica

The cell nucleus is an organelle with a complex spatial organization. The components involved in the different nuclear functions, such as DNA replication and repair, transcription and RNA processing, are not homogeneously distributed in the nuclear space but compartmentalized in different subnuclear domains. In this Thesis, we aimed to study the dynamical organization of a transcription factor in the nucleus, using as a model the glucocorticoid receptor (GR), a ligand-activated transcription factor. The clinical use of glucocorticoids and the need of new synthetic ligands that keep the desired, anti-inflammatory, immunosuppressive effects of glucocorticoids but reduce their adverse, metabolic effects require a precise knowledge of the receptor mechanism of action. By using confocal microscopy and fluorescence correlation spectroscopy (FCS)-based techniques, we explored the spatial subnuclear distribution of the GR and its intranuclear mobility in live cultured cells and found some correlations between these features and GR transcriptional activity. The results show that the inactive GR preferentially localizes in the cytoplasm in nonstimulated cells, while NCoA-2 (a relevant coactivator of nuclear receptors) accumulates in nuclear focal domains identified as promyelocytic leukemia (PML) bodies. GR binding to an agonist such as dexamethasone (Dex) promotes the spatial redistribution of both proteins that co-localize and interact in multiple subnuclear foci. We demonstrate that these foci are dynamic structures that depend on DNA integrity and present a rapid exchange (~1 s) of their components with the nucleoplasm. Additionally, the receptor and its coactivator diffuse within the nucleus and may interact with different chromatin targets, characterized by interaction times of ~500 and ~50 ms (named as long- and short-lived sites, respectively). The interactions of GR with a tandem array of a promoter containing GR target sequences, introduced in a cell line genome, are in the same time scale. Dex-activation produces an increment of both, the long-lived residence time and the relativa population of the receptor bound to long-lived sites. NCoA-2 overexpression also promotes this binding. Symmetrically, GR activation favors the interaction with the coactivator and its recruitment to longer-lived sites. In order to correlate the functionality of the receptor with its intranuclear distribution and dynamics we used receptor mutants and ligands that produce GR conformational variants with poor transcriptional activity. In certain cases, we observed that the impairment of transcription is associated with faster dynamics, homogeneous subnuclear distribution and specially a deficient interaction with NCoA-2. In summary, the dynamical partition of transcription factors in different nuclear reservoirs may impact on their biological function. These interactions as a whole define the local availability of the transcription factor and ultimately the chances to interact with target sequences and regulate gene expression.