Mecanismos Involucrados en la inducción de leptina por estradiol en células placentarias

Abstract

La leptina presenta un papel importante en la reproducción, principalmente se ha sugerido que presenta funciones importantes en la placenta durante la gestación, donde se detectó su expresión y la de sus receptores. En mujeres embarazadas el nivel de leptina en suero aumenta en comparación a las no embarazadas, principalmente durante el segundo y tercer trimestre; aún antes de que se incremente el tejido adiposo.Originalmente la leptina, proteína de 16 kDa codificada por el gen LEP, fue descripta como una molécula producida por el tejido adiposo involucrada en la regulación del metabolismo al nivel central. La leptina placentaria podría tener efectos sobre el crecimiento, la angiogénesis y la inmunomodulación afectando tanto funciones maternas como fetales. En este trabajo, se analizó el efecto del 17β-estradiol (E2) y las vías de señalización y factores de transcripción involucrados, sobre la expresión de la leptina en la placenta humana utilizando dos modelos experimentales, la línea celular BeWo, derivada de coriocarcinoma, y explantos de placentas normales humanas a término.Al analizar la importancia del factor de transcripción Sp1 sobre la regulación de la expresión de leptina mediada por estradiol, pudimos demostrar que la sobreexpresión de este factor incrementa la expresión de leptina determinada por Western blot. Más aún la sobreexpresión de un vector de expresión para Sp1 incrementa tanto la actividad basal del promotor de leptina como la inducida por E2. Específicamente aumenta la actividad de la región del promotor de leptina comprendida entre -1951 y -1887pb que contiene al ?enhancer? placentario de leptina (PLE). Estos resultados fueron confirmados al utilizar un inhibidor de Sp1, el ácido betulínico. En estos experimentos se pierde el efecto inductor de Sp1 sobre la expresión de leptina placentaria. La acción ejercida por este factor de transcripción sobre la expresión de leptina es dependiente de ERα ya que en las células que expresan un siRNA contra este receptor la sobreexpresión de Sp1 no tiene efecto alguno sobre la expresión de leptina. Además al utilizar un vector reportero que contiene el sitio halfERE mutado, la acción de Sp1 parecería anularse. Por otro lado al utilizar un vector que presenta el promotor de leptina con el sitio de unión para Sp1 mutado, la sobreexpresión de ERα no es capaz de inducir la expresión de leptina. Estos resultados sugieren que es necesario que se encuentre intacto el sitio de Sp1 para que se pueda evidenciar el efecto de ERα sobre la expresión de leptina placentaria.Además se evalúo la posible interacción de ERα y Sp1 por inmunoprecipitación. Se demostró que hay interacción entre ambas proteínas, ya que al inmunoprecipitar ERα, se puede evidenciar la presencia de Sp1 en el inmunoprecipitado, y al inmunoprecipitar Sp1 se puede observar ERα en el inmunoprecipitado. Lo que sugiere que habría un efecto cooperativo entre ambos factores en la inducción de la expresión de la leptina placentaria.El antagonista estrogénico, ICI 182,780 no generó inhibición alguna sobre el efecto del Sp1 sobre la expresión de leptina placentaria, lo que sugeriría que la inducción de Sp1 sobre la expresión de leptina no estaría siendo afectada por el inhibidor ICI 182,780.Encontramos también que la expresión basal e inducida por E2 se ve disminuida con el tratamiento con el inhibidor del factor NFκB, sulfasalazina, sugiriendo la participación de los dímeros del NFκB en los efectos regulatorios de dicho esteroide. A través de transfecciones transitorias hemos observado que la sobreexpresión de la subunidad p65 (Rel-A) aumenta la actividad transcripcional basal del promotor de leptina y por otro lado la sobreexpresión de Rel-A en las células BeWo-Sh2, que poseen los niveles de ERα disminuidos por la estrategia de siRNA, produce una marcada disminución de la actividad basal del promotor de leptina, sugiriendo que el efecto de la sobreexpresión de p65 sobre el nivel basal de actividad del reportero sería dependiente de la expresión de ERα ya que al disminuir los niveles de este receptor el efecto de p65 se suprime. Por otro lado la sobreexpresión de p65 no estaría afectando la expresión de leptina mediada por E2 en presencia o ausencia de ERα.Se ha evaluado también la presencia y localización de ERα y la subunidad p65 en las células BeWo, por ensayo de inmunofluorescencia y su posible interacción por coinmunoprecipitación. Hemos encontrado que ambas proteínas se encuentran localizadas en el citoplasma y cuando son sobreexpresadas migran al núcleo. Por otro lado determinamos que en las células BeWo estos dos factores de transcripción estarían interactuando, ya que al inmunoprecipitar ERα, se pudo observar p65 en el inmunoprecipitado. Lo que sugiere que existiría un efecto cooperativo entre el ERα y el NFκB.Hemos observado que el incremento de la expresión de leptina por estradiol en células BeWo depende de la integridad de la vía de señalización mediada por PKA, debido a que tratando a las células con inhibidores de ésta vía, H89 y SQ22536 se produce una disminución de su efecto. También observamos que la sobreexpresión de mutantes dominantes negativas para el factor de transcripción CREB anulan el efecto de estradiol sobre la expresión de leptina placentaria. Por otro lado la sobreexpresión de CBP, produce una estimulación del efecto inductor de estradiol, mientras que la sobreexpresión con HDAC, una deacetilasa de histonas, genera el efecto contrario. El tratamiento con tricostatina A (TSA), un inhibidor de la actividad acetiltransferasa, contrarresta el efecto de HDAC-1. Esto indicaría que la regulación de la expresión de leptina por estradiol sería un proceso multifactorial que involucraría la activación de la vía de señalización de PKA y la modificación de la acetilación de histonas.Los resultados obtenidos contribuyen a mejorar la compresión de la expresión de leptina en la placenta humana así como las vías de señalización y factores de transcripción que actúan en la acción del E2 sobre la expresión de la misma.