Interferencia de herbicida glifosato sobre el control endocrino de la reproducción, en el cangrejo de estuario Neohelice granulata (Decapoda, Brachyura)

Abstract

La presente tesis tuvo como objetivo evaluar los efectos causados por el herbicida glifosato, principalmente en su formulación comercial Roundup Ultramax®, sobre la maduración gonadal y su control endocrino, en hembras y machos del cangrejo Neohelice granulata, de extensa distribución en ambientes estuariales de nuestro país. Para evaluar los efectos sobre el crecimiento ovárico, se realizaron bioensayos in vivo durante el período pre-reproductivo de las hembras (invierno). El ensayo principal consistió en la exposición de las mismas a dos concentraciones subletales de Roundup de relevancia ambiental (0,01 y 0,2 mg/L) durante todo el pre-reproductivo, realizando además un ensayo adicional que sólo comprendió el primer mes de dicho período. Luego de los tres meses de exposición, se observó un aumento de la glucemia y de lípidos en el músculo, no registrándose diferencias en el nivel de glucógeno y proteínas en ese tejido. En el ovario de las hembras expuestas a 0,2 mg/L de Roundup se observó un descenso significativo del contenido de vitelogenina, en correlación con una disminución en el tamaño de oocitos vitelogénicos y una mayor incidencia de oocitos vitelogénicos en reabsorción; a su vez, se observó un descenso en el contenido de vitelogenina hepatopancreática. No obstante, al mes de iniciado el ensayo, el nivel de vitelogenina aumentó significativamente a la mayor concentración de Roundup, en correspondencia con un aumento en la proporción relativa de los oocitos vitelogénicos. Estos resultados sugirieron que un posible efecto de desorganización endócrina por parte del herbicida, podría haber ocurrido en los animales expuestos in vivo. Para validar esta hipótesis, se realizaron ensayos in vitro en el ovario, en los cuales se evaluó la posible interferencia del Roundup sobre hormonas relacionadas con el proceso de maduración gonadal. La exposición directa a 0,01 y 0,2 mg/L de Roundup en el medio de incubación provocó un descenso en el contenido de vitelogenina ovárica, observándose el mismo efecto con glifosato puro, pero sólo a 0,2 mg/L. A la mayor concentración de Roundup, se observó además una inhibición de la síntesis proteica. Histológicamente, sin embargo, se observó un avance en la maduración ovárica, sugiriendo nuevamente un posible efecto de desorganización endocrina. La co-incubación del ovario con extracto de ganglio torácico (secretor de un factor estimulante del crecimiento gonadal), o con extracto de pedúnculo ocular (productor de una neurohormona inhibitoria) no mostró una interferencia evidente del Roundup con las neurohormonas o factores presentes en tales extractos. En cambio, sí se observó por parte del Roundup un efecto facilitador del aumento en el contenido de vitelogenina producido por progesterona (1,5 μM). En un ensayo in vitro posterior, en el cuál se incubó el ovario con mifepristona (antagonista de los receptores de progesterona), el agregado del herbicida no modificó el nivel de vitelogenina. Estos resultados sugieren que el Roundup actuaría como inductor de la vía de transducción de la hormona, o eventualmente como un xenoprogestágeno, aportando indicios para explicar, al menos en parte, la estimulación ovárica observada in vivo, al mes de iniciada la exposición. Finalmente, el ensayo in vitro realizado con el inhibidor de prostaglandinas ibuprofeno, mostró que el agregado de Roundup aumenta el efecto inhibitorio del ibuprofeno sobre la disminución del contenido de vitelogenina. Este resultado, en conjunto con la inhibición de la síntesis proteica, la menor disponibilidad de vitelogenina en el hepatopáncreas y la mayor incidencia de reabsorciones, aporta indicios para explicar la inhibición del crecimiento ovárico observado al finalizar los tres meses de exposición in vivo. En cuanto a los machos, se realizó un primer ensayo in vivo de 30 días de duración, dentro del período pre-reproductivo, a fin de evaluar el efecto sobre la maduración gonadal, tanto del Roundup como del glifosato puro. En este ensayo, se observó con ambos herbicidas una menor ganancia en peso, en correlación con un menor contenido de proteína muscular, si bien el nivel de glucógeno se vio incrementado. El análisis histológico de las gonadas indicó una proporción significativamente más alta de espermatóforos anormales (presentando áreas concéntricas desprovistas de espermatozoides) tanto a 1 mg/l de Roundup como de glifosato puro, en concordancia con una disminución en el número de espermatozoides por espermatóforo. En un segundo ensayo in vivo, también de 30 días de duración, se propuso evaluar la viabilidad espermática, mediante la técnica de tinción doble con las sondas fluorescentes Sybr®/ Ioduro de propidio; observándose un aumento no significativo de la mortalidad. Finalmente, se realizó un ensayo in vitro incubando testículo y vaso deferente (proximal y medio) con Roundup 1 mg/L, en presencia o ausencia de glándula androgénica. Los resultados obtenidos mostraron que el aumento en el número de espermatozoides por espermatóforo, producido por la glándula androgénica, era revertido a los niveles del control por la exposición a Roundup, sugiriendo que éste podría inhibir la secreción y/o el efecto de la hormona secretada por esta glándula, si bien el herbicida per se produjo un descenso significativo en el número de espermatozoides.

The objective of the present study was to evaluate the effects caused by the herbicide glyphosate, mainly in its commercial formulation Roundup Ultramax®, on the gonadal maturation and its endocrine control, of both females and males of the crab Neohelice granulata, which has an extensive distribution in estuarial environments of our country. To evaluate the effects on ovarian growth, in vivo bioassays were first performed, during the pre-productive period of the females (winter). The main bioassay consisted of exposing the females to two sublethal concentrations of Roundup having environmental relevance (0.01 and 0.2 mg/L) during the complete pre-productive period (three months), also carrying out an additional assay that only included the first month of the mentioned period. After three months of exposure, an increase in blood glucose and muscle lipids was observed, with no significant changes in glycogen or protein in that tissue. In the ovary of the females exposed to 0.2 mg/L of Roundup, however, a significant decrease in the vitellogenin content was observed, in agreement with a decrease in the size of vitellogenic oocytes and a higher incidence of vitellogenic oocytes in reabsorption. On the other hand, a decrease in hepatopancreatic vitellogenin content was observed at the aforementioned concentration. However, one month after the beginning of the assay, the level of vitellogenin increased significantly at the highest Roundup concentration, in relation with an increase in the relative proportion of vitellogenic oocytes, suggesting that some type of endocrine disruption took place at that time of exposure. To validate this hypothesis, in vitro tests were performed. Direct exposure to 0.01 and 0.2 mg/L of Roundup in the incubation medium caused a decrease in the content of ovarian vitellogenin, observing the same effect with pure glyphosate, but only at 0.2 mg/L. At this concentration of Roundup, an inhibition of protein synthesis was also observed. Histologically, however, an advance in ovarian maturation was observed, suggesting again a possible effect of endocrine disruption. The co-incubation of ovarian with extract of thoracic ganglion (secretor of a gonadal growth stimulating factor), or with eyestalk extract (producer of an inhibitory neurohormone) did not show any evident interaction of Roundup with the neurohormones or factors present in such extracts. Besides, a facilitating effect of Roundup was observed on the increase in vitellogenin content produced by the addition of progesterone (1.5 μM) to the incubation medium. In a subsequent in vitro assay, in which the ovary was co-incubated with mifepristone (progesterone receptor blocker), the addition of Roundup did not modify the level of vitellogenin. These results suggest that Roundup would act as an enhancer of the hormone transduction pathway, or eventually as a xenoprogestogen, serving as a basis to explain, at least in part, the ovarian stimulation observed in vivo, one month after initiating the exposure to Roundup. Finally, the in vitro assay performed with the prostaglandin inhibitor ibuprofen showed that the addition of Roundup increases such inhibitory effect, further reducing the vitellogenin content. This result serves as a basis to explain (along with the inhibition of protein synthesis, the lower availability of vitellogenin in the hepatopancreas and the higher incidence of oocyte reabsorption) the inhibition of ovarian growth observed at the end of the three months-in vivo exposure. Regarding males, a first 30-day in vivo assay was performed within the reproductive period, with both Roundup and pure glyphosate, in order to evaluate the effect on testicular maturation. In this assay, a lower weight gain was observed with both products, in relation with a lower content of muscle protein, although the glycogen level in muscle increased. Histological analysis of the gonads indicated a significantly higher proportion of abnormal spermatophores (presenting concentric areas devoid of spermatozoids) at 1 mg/L of Roundup or pure glyphosate, in agreement with a decrease in the number of spermatozoa per spermatophore. A second in vivo assay, also comprising 30 days of duration, was aimed at evaluating the sperm viability, by means of the fluorescence produced by the staining with the probes Sybr®/propidium iodide. An increase in sperm mortality due to Roundup effects was observed at 1 mg/L, although it was not significant with respect to control. Finally, an in vitro assay was performed co-incubating both testis and vas deferens (with or without adittion of androgenic gland), with the eventual addition of Roundup to the incubation medium, at 1 mg/L. The results obtained showed that the increase in the number of spermatozoa produced by the androgenic gland was reverted to control levels by Roundup, suggesting that it could inhibit the secretion and/or the effect of the hormone secreted by such gland, although the herbicide produced, per se, a significant decrease in the number of sperm.