Láminas de mioblastos diafragmáticos genéticamente modificados para la prevención y reversión del remodelamiento ventricular izquierdo en un modelo ovino de infarto agudo de miocardio

Abstract

Introducción: Los mioblastos diafragmáticos (MD) son células madre del diafragma, músculo de gran resistencia al estrés y agotamiento. Hipotetizamos que MD modificados para sobreexpresar conexina 43 (cx43), cultivados en láminas de poli-(l-ácido láctico) (PLLA) con nanofibras alineadas, disminuirían el tamaño de infarto, prevendrían el remodelamiento y mejorarían la función ventrícular en ovejas con infarto agudo de miocardio (IAM).Métodos: A partir biopsias de diafragma se aislaron, cultivaron y caracterizaron MD por inmunomarcación y capacidad de diferenciación a miotubos. Luego de transducidos con un lentivirus portador del gen cx43, se constató su expresión (RT-qPCR y Western blot) y la conectividad intercelular por FRAP (fluorescence recovery after photobleaching).Además, láminas con diferentes patrones de alineamiento de las nanofibras de PLLA fueron obtenidas por electrospinning. Se seleccionó la condición de mayor perfil de alineamiento de las nanofibras de PLLA para favorecer el alineamiento celular.Por último, ovejas con IAM fueron tratadas con láminas de PLLA sin MD (grupo PLLA), láminas de PLLA con MD (grupo PLLA-MD), láminas de PLLA con MD que sobreexpresan cx43 (grupo PLLA-MDcx43) o ausencia de tratamiento (Placebo, n=6 por grupo). A 48-72 hs y 45 días post-IAM se midió tamaño de infarto (resonancia magnética cardíaca, RMC) y función ventricular (ecocardiografía). A 45 días se cuantificó la densidad microvascular, la fibrosis y la expresión génica en la región peri-IAM.Resultados: El tamaño de infarto se redujo ~25% en PLLA-MDcx43 [de 8,17±0,6 ml (día 2 post-IAM) a 6.5±0,72 ml (día 45), p<0,01, ANOVA-Bonferroni] pero no en los otros grupos. El volumen de fin de diástole a 45 días aumentó significativamente en los 4 grupos. La fracción de eyección (FEy%) a 3 días post-IAM cayó significativamente en todos los grupos. A 45 días, los grupos PLLA-MD y PLLA-MDcx43 recuperaron valores de FEy% estadísticamente similares a los pre-IAM (PLLA-MD: 61,1±0,5% vs. 58,9±3,3%, p=NS; PLLA-MDcx43: 64,6±2,9% vs. 56,9±2,4%, p=NS), pero no los grupos Placebo (56,8±2% vs. 43,8±1,1%, p<0,01) y PLLA (65,7±2,1% vs. 56,6±4,8%, p<0,01). La densidad capilar fue mayor (p<0,05) en el grupo PLLA-MDcx43 que en los otros, y el remodelamiento ventricular, según los valores finales de volumen de fin de diástole y de fibrosis en el miocardio normoperfundido peri-infarto, fue similar entre grupos. Conclusión: Las láminas de PLLA con MDcx43 reducen el tamaño de infarto pero mejoran la función ventricular en igual medida que las células sin translucir. Ninguno de los tratamientos previene significativamente el remodelamiento ventricular.

Introduction: Diaphragmatic myoblasts (DM) are stem cells of the diaphragm, a muscle displaying high resistance to stress and exhaustion. We hypothesized that DM modified to overexpress connexin 43 (cx43), seeded on aligned poly (l-lactic acid) (PLLA) sheets would decrease infarct size, prevent remodeling and improve ventricular function in an ovine model of acute myocardial infarction (AMI). Methods: DM were isolated from diaphragm biopsies, cultured and characterized by immunocytochemistry and myotube differentiation capacity. After transduction with a lentivirus encoding the cx43 gene, we assessed cx43 expression (RT-qPCR and Western blot) and inter-cellular connectivity (fluorescence recovery after photobleaching, FRAP). In addition, sheets exhibiting diverse patterns of nanofibers alignment were obtained by electrospinning. The condition with the best PLLA nanofibers alignment was selected to enhance cell alignment. Finally, sheep with AMI received PLLA sheets without DM (PLLA group), sheets with DMs (PLLA-DM group), sheets with DMs overexpressing cx43 (PLLADMcx43) or no treatment (Placebo group, n=6 per group). At 2-3 days and 45 days post-AMI, infarct size (cardiac magnetic resonance) and left ventricular function (echocardiography) were assessed. At 45 days, microvascular density, fibrosis and gene expression were assessed in the peri-infarct zone. Results: Infarct size decreased ~25% in PLLA-MDcx43 [from 8.17±0.6 ml (day 2) to 6.5±0.72 ml (day 45), p<0.01, ANOVA-Bonferroni] but not in the other groups. Ejection fraction (EF%) (echocardiography) at 3 days post-AMI fell significantly in all groups. At 45 days, PLLA-DM y PLLA-DMcx43 recovered their EF% to pre-AMI values (PLLA-DM: 61.1±0.5% vs. 58.9±3.3%, p=NS; PLLA-DMcx43: 64.6±2.9% vs. 56.9±2.4%, p=NS), but not so in Placebo (56.8±2% vs. 43.8±1.1%, p<0.01) and PLLA (65.7±2.1% vs. 56.6±4.8%, p<0.01). Capillary density was higher (p<0.05) in PLLADMcx43 group than in the remaining groups. Ventricular remodeling, according to left ventricular end diastolic volume and amount of fibrosis in the normoperfused periinfarct zone, was similar across groups. Conclusion: PLLA sheets seeded with DMcx43 reduce infarct size, but are similarly effective than non-transduced DM in terms of ventricular function. None of the treatments prevent ventricular remodeling significantly.