Mecanismos que controlan el desarrollo de inflamación mediada por neutrófilos

Abstract

Los neutrófilos son leucocitos que cumplen un papel clave en la defensa antimicrobiana. Éstos constituyen las células más numerosas de la sangre periférica, con una producción que se incrementa dramáticamente durante la inflamación o infección sistémicas. Tradicionalmente se les ha adjudicado un papel microbicida en la respuesta inmune, pero estudios recientes demostraron que pueden modular el curso de las mismas a través de la secreción de citoquinas entre las cuales se encuentra la Interleuquina-1β (IL-1β). Ésta es una citoquina proinflamatoria central en procesos fisiopatológicos que ejerce efectos pleiotrópicos tanto sobre el sistema inmune innato como el adaptativo. La IL-1β es sintetizada como un precursor inactivo que requiere clivaje proteolítico para ser activado. En respuesta a la estimulación con LPS y ATP, los neutrófilos humanos sintetizan pro-IL-1β y median la generación de su forma activa a través de la caspasa-1 tras la activación del inflamasoma. La IL-1β carece de péptido señal, por lo que es sintetizada en el citoplasma y secretada por vías no convencionales de naturaleza controvertida, que son independientes de la vía canónica que involucra al retículo endoplásmico-aparato de Golgi. En este trabajo de tesis, a través de estudios cinéticos cuantitativos que involucraron inmunomarcaciones, técnicas de microscopía confocal y cuantificación de las imágenes, así como ensayos de ELISA específicos y western blot, aportamos evidencias que sustentan que un mecanismo de autofagia secretoria se encuentra involucrado en la exportación de IL-1β en neutrófilos humanos. Estos estudios también indicaron que aun cuando los neutrófilos humanos liberan pro-IL-1β, su secreción no está mediada por autofagia. Además, los resultados evidenciaron que las serinproteasas neutrofílicas regulan la secreción de la IL-1β. Nuestros hallazgos indicaron que la IL-1β es secretada mayoritariamente en forma soluble, y sólo en una mínima proporción dentro de microvesículas y exosomas. Los resultados son compatibles con un modelo que involucra la participación de la chaperona HSP-90 y de la gasdermina D en la translocación de la IL-1β a las vesículas. Nuestros hallazgos también sugirieron que la autofagia controla el destino de los inflamasomas. Teniendo en cuenta las diversas condiciones de naturaleza infecciosa e inflamatoria en las que los neutrófilos infiltran masivamente los tejidos, los resultados de esta tesis aportan blancos moleculares potenciales, que podrían ser sujeto de investigaciones en el futuro para el diseño de nuevas estrategias terapéuticas para mitigar la inflamación en patologías en las cuales la IL-1β neutrofílica cumpla un papel relevante en su patogénesis.

Neutrophils are leukocytes that play a key role in antimicrobial defense. They constitute the most numerous cells in human peripherical blood, increasing dramatically their number during inflammation o systemic infections. Neutrophils have been traditionally considered within the innate immune response setting for its antimicrobial capacity. However, recent studies have shown that these cells may potentially modulate the course of an immune response by producing and releasing different cytokines, like Interleukin‐1β (IL‐1β). This is a key pro‐ inflammatory cytokine that exerts pleiotropic effects on both the innate and adaptive immune system. IL‐1β is synthesized as a precursor that requires enzymatic processing in order to be activated. In response to LPS and ATP stimulation, human neutrophils produce pro‐IL‐1β and mediate the generation of the biological active isoform through activation of the inflammasome and caspase‐1. Unlike proteins endowed with the leader (N‐terminal signal) peptide, IL‐1β is a leaderless cytosolic protein which cannot enter the conventional secretory pathway normally operating via the endoplasmic reticulum and the Golgi apparatus. The mechanisms involved in its secretion are still controversial. In this thesis work we obtained evidence that supports that an autophagic secretory mechanism is involved in IL‐1β exportation from human neutrophils, by immunostaining, confocal microscopy, quantitative image analysis specific ELISA assays and Western Blot. Moreover, our studies indicated that even though neutrophils release pro‐IL‐1β, its secretion is not mediated by autophagy. Furthermore, our results pointed out that neutrophil serineproteases can regulate IL‐1β secretion. Our findings also suggest that IL‐1β is mainly exported soluble and a minimal proportion through exosomes and microvesicles. The results agree with a model that involves the participation of the chaperone HSP‐90 and Gasdermin D in the translocation of IL‐1β into the vesicles. Our findings also suggested that autophagy controls the fate of inflammasomes. Considering the diverse infectious and inflammatory conditions in which neutrophils massively infiltrate the tissues, the results presented in this thesis provided evidence of potential molecular targets that could be evaluated in the future to design new therapeutic strategies to mitigate inflammation in those pathologies in which neutrophil IL‐1β plays a significant role in their pathogenesis.