Rol de los ARN no codificantes en la respuesta al estrés oxidativo en condiciones fisiológicas y en el cáncer

Abstract

ARNs no codificantes largos transcriptos a partir de los telómeros,conocidos como TERRA (telomeric repeat-containing RNA), se asocian a laestabilidad telomérica y genómica. Están aumentados en tejidos tumoraleshumanos y murinos, aunque poco se sabe sobre los mecanismos que subyacendicho aumento y las funciones que cumplen. El estrés oxidativo daña biomoléculasy activa vías de señalización asociadas a la proliferación celular, angiogénesis,apoptosis y metástasis. Los telómeros son regiones del genoma especialmentesusceptibles a sufrir daño oxidativo y se ha reportado que la inflamación crónica invivo induce disfunción telomérica por sobreproducción de ROS vía COX-2, lo cuales revertido por tratamiento antiinflamatorio ó antioxidante. Consecuentemente,los objetivos de este trabajo de Tesis fueron caracterizar la expresión de losTERRA frente al estrés oxidativo, determinar los mecanismos involucrados yevaluar su relevancia en la progresión tumoral.Se observa que los TERRA se inducen a las 4 h de tratamiento con losagentes oxidantes H2O2, NaAsO2 ó butionina sulfoximina en células renalesembrionarias humanas HEK-293T. El uso del antioxidante N-acetil-L-cisteínapreviene dicho aumento. Se ha demostrado que hay aumento de ROS en el tejidoadiposo pardo de ratones expuestos al frío, pero no en el blanco. En el presentetrabajo se reporta que los TERRA se inducen sólo en el tejido adiposo pardo deratones C57BL/6J luego de 4h de ser expuestos al frío, siendo esta la primerevidencia experimental que los TERRA se inducen in vivo en una condiciónfisiológica que cursa con aumento de ROS. Por ChIP se evidenció que el H2O2induce aumento de las marcas de histonas y proteínas asociadas a activatranscripción en la región subtelomérica de las HEK-293T, donde se hallan lospromotores de los TERRA. Ensayos de RIP muestran que los TERRA interactúancon las proteínas HP1α/γ, ambas reclutadas al subtelómero. Ensayos deFinmunoprecipitación para estas proteínas sugieren que sólo HP1γ interactúa con lamaquinaria transcripcional. Se encuentra descripto que las proteínas del poronuclear (Nups) se asocian a genes transcripcionalmente activos, desconociéndoselos factores que median su interacción con la cromatina. En este trabajo seevidenciaron a las Nups presentes en complejo con HP1γ y reclutadas alsubtelómero tanto antes como después de la exposición al H2O2, sugiriendo queintervienen en la expresión de los TERRA por medio de HP1γ.La inducción de los TERRA se revierte 1-2 h luego de haber quitado el H2O2del medio de cultivo. Esta expresión dinámica de los TERRA sugiere que ejercenun rol protector. En línea con esta idea, se observa una rápida inducción deTERRAs frente a un segundo desafío con H2O2. Ensayos de ChIP sugieren queesto es posible gracias a que se conservan en la región subtelomérica las marcasepigenéticas que favorecen la transcripción luego de la primera exposicióntransitoria al H2O2, dejándolos ?preparados? para que sean transcriptos.H89, un inhibidor de la PKA, bloquea la inducción de los TERRA porexposición al H2O2, sugiriendo que PKA controla su expresión. El uso de drogasque alteran la estabilidad de los microtúbulos modula los niveles de los TERRA, aligual que ocurre cuando se cultivan células sobre superficies de diferente rigidezpara modificar la disposición del citoesqueleto. También se observa modulación deTERRAs durante la miogénesis, proceso en el que hay una reorganizacióndramática del citoesqueleto. De hecho, los rearreglos del citoesqueleto en célulasNMuMG que atraviesan la transición epitelio-mesenquimal (TEM) por tratamientocon TGFβ1, se asocian a inducción de TERRAs y a ausencia de respuesta alH2O2, tal como ocurre en las células de adenocarcinoma mamario T47D quepresentan disfunción telomérica, evidenciado por microscopía confocal. En suconjunto, los resultados aportan evidencias que los TERRA se inducen por estrésoxidativo y durante la TEM, señalando su potencial utilidad como marcadorestempranos de progresión tumoral.

Long non-coding RNAs transcribed from telomeres, known as TERRA (telomeric repeat-containing RNA), are associated with telomere and genome stability. TERRA expression is elevated in human cancer tissues, however little is known about their function. Oxidative stress damages biomolecules and activates signaling cascades involved in cell proliferation, apoptosis, and metastasis. Since telomeres are prone to oxidative damage leading to their dysfunction, the objective of the present work is to characterize TERRA expression in oxidative stress, the mechanisms involved and its relevance in EMT. H2O2 induces TERRA expression in HEK-293T cells, and is prevented by antioxidant treatment. It was reported ROS are increased in brown (BAT) but not in white adipose tissue of mice exposed to cold. Importantly, we found increased TERRAs only in BAT of mice exposed to cold. In HEK-293T cells exposed to H2O2, ChIP shows that chromatin landscape is modified favoring telomere transcription. TERRAs interact with HP1α/γ, both proteins found recruited to subtelomeres. HP1γ interacts with transcriptional machinery and nuclear pore complex proteins, suggesting they are involved in TERRA regulation. TERRA induction is lost 1-2h after removal of H2O2 from culture medium, suggesting they have protective functions. This is supported by rapid increase of TERRA upon a second H2O2 challenge. PKA inhibitor H89 blocks the increase of TERRA induced by H2O2, suggesting that PKA controls TERRA induction. Treatment of cells with drugs that disturb cytoskeleton integrity or growing cells on surfaces of different stiffness that generate differential cytoskeleton organization also modifies TERRA levels. In fact, cytoskeleton rearrangements of EMTtransformed NMuMG cells associate with higher TERRAs and lack response to H2O2, mimicking what occurs in breast cancer cells that exhibit telomere dysfunction evidenced by confocal microscopy. In summary, we show that TERRAs are induced in response to oxidative stress and during EMT, being potentially novel early markers of cancer progression.