Efecto del plasma seminal sobre los espermatozoides criopreservados de llama (Lama glama)

Abstract

El plasma seminal (PS) es mucho más que un medio de sostén y nutrición para los espermatozoides y, particularmente en los Camélidos Sudamericanos (CSA) ha demostrado estar implicado en múltiples eventos fisiológicos reproductivos. Es así que, no solo contienefactores involucrados en la inducción de la ovulación en las hembras luego del servicio natural sino que también, está implicado en el momento indicado para el encuentro de las gametas,debido a que participa en la formación de un reservorio espermático. Las particularidades de los eyaculados de estas especies; alta filancia, elevada viscosidad estructural y presencia de movilidad espermática oscilatoria están determinadas por el PS. A pesar de los múltiples reportes acerca del rol del PS en la fisiología reproductiva de estas especies, pueden existir efectos a nivel espermático aún no dilucidados. Los objetivos particulares de la presente tesis fueron: 1- evaluar el efecto de incubar espermatozoides de semen fresco de llama en distintas diluciones de PS, 2- evaluar in vitro el efecto de agregar PS a espermatozoides postdescongelados de llama, 3- evaluar in vitro el efecto del agregado de PS previo al proceso de criopreservación sobre espermatozoides post-descongelados de llama y 4- obtener preñez con semen congelado de llama.Los resultados del objetivo particular 1, permitieron establecer que el PS modifica elpatrón de movilidad de los espermatozoides de semen fresco y a su vez, éste patrón esdiferente según la cantidad de PS presente en el medio. Por otro lado, el uso de 100% PS no es capaz de mantener la movilidad y la integridad y funcionalidad de membrana a lo largo de 3 hs de incubación a 37°C. Además, el porcentaje de espermatozoides con acrosoma presente fue menor en todos los tiempos de incubación en las muestras sin PS (0%). Mientras que, lasmuestras incubadas con 10 y 50% de PS preservaron dichas características espermáticas a lolargo de la incubación. Los resultados del citado objetivo indicarían que es necesarioincorporar un medio de sostén a los espermatozoides de llama además del PS para mantenera los mismos viables y con sus membranas funcionales a lo largo del tiempo. Por otro lado, es necesario agregar cierto porcentaje de PS al medio de incubación para ejercer un roldecapacitante que evite la reacción acrosomal espontánea de los espermatozoides en eltiempo. Los objetivos particulares 2 y 3 se desarrollaron en espermatozoides criopreservados dellama, donde se evaluó el agregado de PS (10 y 50%) en forma posterior y en forma previa alproceso de congelamiento, respectivamente. En ambos casos, se observó un descensosignificativo en los porcentajes de movilidad espermática, viabilidad (CFDA/PI y FITC-PNA/PI) y funcionalidad de membrana con respecto al semen fresco. A partir de la evaluación con FITCPNA/PI se determinó que dicho descenso en el porcentaje de espermatozoides vivos ocurrió, en ambos experimentos, a expensas de un incremento en el porcentaje de espermatozoides muertos reaccionados (p<0,05). También, en ambos objetivos los protocolos decriopreservación utilizados comprometieron la calidad del ADN espermático, observándosedaño por fragmentación posdescongelado con respecto al semen fresco. Sin embargo, ambosprotocolos no modificaron el grado de condensación de la cromatina espermática. Tampoco,se vio alterada la morfología de los espermatozoides congelados, no existiendo diferenciassignificativas (p>0,05) entre el semen fresco y los protocolos empleados en ambos objetivosparticulares. La adición de 10% y 50% de PS (objetivo particular 2) al descongelado fue incapaz de preservar la movilidad espermática o mejorar la supervivencia de los espermatozoides congelados-descongelados de llama en el tiempo. A pesar de la rápida pérdida de movilidad después del descongelado, la viabilidad y la funcionalidad de membrana se preservaron a lo largo del tiempo (3 hs). Por otra parte, la adición de PS previo al proceso de congelación de los espermatozoides en las concentraciones finales probadas en la presente tesis (objetivo particular 3), con el diluyente base utilizado y la curva de congelamiento profundo empleada,no protegerían del daño por congelamiento ni evitarían la criocapacitación de los espermatozoides de llama.Al realizar IA con semen congelado a partir de los protocolos desarrollados en lapresente tesis no se logró preñez. Estos resultados indican la necesidad de seguir investigando las particularidades fisiológicas de los espermatozoides de llama, así como también, estudiar su comportamiento frente al uso de otros protocolos de congelamiento e incluso frente a la combinación de diferentes crioprotectores (CP). Sería importante determinar la composición de la membrana espermática en estas especies, para vincular sus particularidades con el comportamiento espermático durante la criopreservación.

It has been demonstrated that the role of seminal plasma on sperm physiology is not only to act as a transportation media for spermatozoa and provide nutrition, but a more complex link exists between them, especially in the reproductive physiology of South American Camelids. SP not only contains factors involved in the ovulatory response of the females after natural mating but, due to its role in the formation of the sperm reservoir, it is also involved in the timing of the gametes’ encounter. Semen particularities in these species such as; thread formation, high viscosity and the presence of oscillatory motility defined by SP. Despite multiple reports on the role of SP in the reproductive physiology of these species, there could be more effects on spermatozoa that are not yet stablished. The objectives of this thesis were: 1- evaluate the effect of incubating raw llama sperm with different concentrations of SP; 2- evaluate, in vitro, the effect of incubating post-thaw llama spermatozoa with different concentrations of SP; 3- evaluate the in vitro effect on llama sperm of adding different percentages of SP prior to the cryopreservation; 4- obtain pregnancies after artificial insemination of cryopreserved llama sperm. The results of the first objective demonstrated that sperm motility differs according to the quantity of SP present in the media, thus showing that SP is involved in the motility pattern of llama sperm. The use of 100% SP is not able to maintain sperm motility and membrane viability and function over time (3 h). However, a certain percentage of SP is necessary in media to avoid spontaneous acrosome reactions in spermatozoa. In addition, the percentage of sperm with reacted acrosomes was higher in the samples without SP (0%) at all the incubation times. On the other hand, adding 10 and 50% SP to media did not show superiority on preserving sperm characteristic over time (sperm motility, membrane integrity and function and acrosome status). These results could indicate that it is necessary to use a support media in addition to SP to preserve sperm with viable and functional membranes over time. Also, that a certain percentage of SP in the media is necessary to exert a decapacitating role to avoid spontaneous acrosome reactions. The addition of SP (10 and 50%) prior to and after cryopreservation of llama sperm was evaluated in objectives 2 and 3 of this thesis. In both cases, a significant decrease in sperm motility, viability (CFDA/PI and FITC-PNA/PI), membrane function and intact acrosomes was observed in all thawed samples (0, 10 and 50% SP) when compared to raw semen. Using the FITC-PNA/PI stain it was established that the decrease in sperm viability in both experiments, was at the expense of an increase in the percentage of dead, reacted sperm (p<0.05). In addition, a significant increase in sperm with fragmented DNA was observed in thawed samples of both objectives compared to raw semen. Nevertheless, no alteration in chromatin condensation was observed in thawed samples, nor was morphology altered when comparing raw semen and all post-thaw samples (0, 10 and 50% SP). Post-thaw addition of 10% and 50% seminal plasma (objective 2) was unable to preserve sperm motility or improve the survival of llama frozen-thawed spermatozoa. Despite the rapid loss of motility of post-thaw llama spermatozoa, membrane integrity and function were preserved over 3 h of incubation. On the other hand, the addition of SP prior to the freezing of llama spermatozoa (objective 3) showed no cryoprotective effect and would not prevent the cryocapacitation of llama sperm. In addition, none of the three cryopreservation protocols evaluated showed superiority over the others in preserving llama sperm characteristics, at least with the freezing curve evaluated in this study. In this thesis, pregnancies were not obtained when artificial insemination with frozenthawed semen was performed. These results indicate the need for further research in llama sperm physiology and semen cryopreservation. Different cryopreservation protocols could be assayed, including the combination of diverse cryoprotectants. It would be important to determine the composition of sperm membranes in these species, as this would throw some light on the behavior observed in cryopreservation and could lead to improvements in current freeze-thawing protocols.