Genómica, proteómica y fisiología de neuropéptidos en el insecto triatomino Rhodnius prolixus: Oportunidades para el diseño de nuevas estrategias de control de Chagas

Abstract

En Argentina existen aproximadamente 2.300.000 infectados de Chagas. El control del insecto vector continúa siendo la opción más viable como control y prevención de la enfermedad. En las últimas dos décadas se detectó la existencia de poblaciones de triatominos resistentes a insecticidas (Triatoma infestans), en las provincias de Chaco, Salta, y en el Sur de Bolivia. Esto representa un grave riesgo para el control de la enfermedad de Chagas en Argentina y la región. El presente trabajo utiliza como organismo modelo al triatomino R. prolixus. Este insecto reúne una serie de características favorables para su uso como modelo en fisiología de insectos: es el segundo vector más importante de la enfermedad de Chagas; posee características favorables para su cría; se conoce su secuencia genómica; los resultados obtenidos en R. prolixus potencialmente pueden aplicarse a otros triatominos, en incluso otros insectos. Particularmente, para estudios de desarrollo post-embrionario como los realizados en este trabajo, una ventaja del modelo es que el ciclo de muda se desencadena de manera predecible tras la ingesta de sangre, lo que permite sincronizar los experimentos. Este trabajo de Tesis se inscribe en el marco de alcanzar alternativas de control de insectos perjudiciales, que resulten más eficientes, selectivas y seguras para el medio ambiente respecto a los insecticidas neurotóxicos en uso. En éste sentido, se estudian los neuropéptidos, hormonas peptídicas que regulan todos los procesos vitales en organismos multicelulares. El estudio de estas moléculas tiene potencial aplicabilidad para el diseño de insecticidas. Podría permitir el diseño de pseudo-péptidos o péptidomiméticos capaces de interferir con la fisiología de insectos de importancia sanitaria o económica, constituyendo una vía novedosa hacia la obtención de nuevos insecticidas. Entre los resultados alcanzados en el trabajo, en primer lugar, se identificó una nueva isoforma del gen de orcokininas, codificante para un precursor de neuropéptidos en R. prolixus. Esta isoforma, llamada “Orcokinina C” no fue identificada hasta el momento en ninguna otra especie de insectos. Se determinó su secuencia, su estructura molecular y los péptidos maduros generados por clivaje proteolítico. 4 Por otro lado se determinó el patrón de expresión en tejidos de las tres isoformas del gen orcokinina en R. prolixus (RhoprOKA, RhoprOKB y RhoprOKC). Se completó el patrón de expresión de RhoprOKA en tejidos periféricos y para RhoprOKB en sistema nervioso central y tejidos periféricos por inmunohistoquímica. Se encontró que ambas isoformas se expresan en gónadas, y que RhoprOKB también está presente en intestino medio. RhoprOKC fue detectado únicamente en intestino medio por medio de RT-qPCR. Por otro lado, se determinó el patrón de expresión temporal de RhoprOKA y RhoprOKB a lo largo de todo el ciclo de muda en ninfas de cuarto estadio. Se observó que tanto OKA como OKB aumentan su expresión hacia final del ciclo de muda día 12 post ingesta (PBM), lo cual es un primer indicio sobre su papel en el proceso de ecdisis, confirmado durante el trabajo por otras aproximaciones. Se evaluó la relación de las OKs con la síntesis de ecdisteroides mediante dos aproximaciones experimentales: análisis cuantitativo de la expresión de “genes reporteros” ligados a cambios en la concentración de ecdisteroides; y medición directa de la concentración hemocélica de ecdisteroides mediante ELISA competitivo. En conjunto, los resultados apuntan a un papel ecdisteroidostático de la isoforma RhoprOKA. Se estudió el papel de RhoprOKs por medio de silenciamiento transcripcional mediado por RNA de interferencia. Los resultados confirmaron un papel central de RhoprOKA en la regulación de la ecdisis, y un posible papel contributivo de RhoprOKB en este proceso; los insectos que expresan niveles significativamente reducidos de RhoprOKA fueron incapaces de completar una ecdisis exitosa. Se estudió el efecto de RhoprOKs sobre la expresión de otros genes relacionados al proceso de ecdisis. El silenciamiento de este gen en ninfas cuarto estadio se correspondió con una disminución en el nivel de expresión de neuropéptidos centrales en la regulación del proceso de muda: ETH: hormona desencadenante de la ecdisis; EH: hormona de la eclosión; CZ: corazonina y CCAP: péptido cardio-acelerador de los crustáceos, medido el día 11 PBM (aproximadamente 1-2 días pre-ecdisis). Se observó que el silenciamiento de la isoforma RhoprOKA produce una disminución de la expresión de los genes RhoprETH y RhoprCCAP, al tiempo que un aumento de la expresión de RhoprEH y RhoprCZ. Este aumento se confirmó en dos días diferentes del 5 ciclo de muda: día 6 PBM (durante el pico de ecdisona) y día 11 PBM (justo antes de la ecdisis). El silenciamiento de la isoforma RhoprOKB produjo un efecto más restringido en la expresión de otros genes: una disminución de RhoprCCAP el día y un aumento de RhoprCZ el día 11 PBM. Se determinó además la expresión de los transcriptos RhoprETH, RhoprEH y RhoprCZ, en ninfa 4ta durante todo el ciclo de muda. Se observó un aumento en el nivel de expresión en los días 6, 10 y 12 PBM para RhoprETH; un aumento en el nivel de expresión en los días 10 y 12 PBM para RhoprEH y un aumento en el nivel de expresión en el día 12 PBM para RhoprCZ. Es la primera vez que se realiza este tipo de análisis en un insecto hemimetábolo. Los patrones de expresión coinciden con lo reportado en la bibliografía para especies holometábolas. Se realizó el silenciamiento de la expresión de los genes RhoprETH, RhoprEH y RhoprCZ mediante RNA interferencia. Los resultados apuntan a que estos neuropéptidos conforman una red de regulación de la ecdisis, de manera similar a lo reportado para especies holometábolas. Es el primer trabajo en realizar este tipo de análisis en hemimetábolos. Los resultados sugieren que el péptido RhoprCZ estimula la síntesis de RhoprETH (tal como sucede en lepidópteros). Existe por otro lado un ciclo de regulación positiva entre RhoprETH y RhoprEH, observado también en especies holometábolas con la excepción de D. melanogaster. Por ultimo ETH regula la expresión de RhoprCCAP, y RhoprOKA y RhoprOKB. Se utilizó una preparación in vitro para estudiar la interacción entre orcokininas, ecdisona y neuropéptidos asociados a la regulación de la ecdisis. Los resultados indican que la ecdisona, en determinadas condiciones fisiológicas, estimularía la síntesis de la isoforma RhoprOKA, que a su vez reprimiría la expresión de los genes RhoprCZ, RhoprETH, RhoprEH, RhoprCCAP y la isoforma RhoprOKB. En conjunto, los resultados obtenidos mediante distintas aproximaciones experimentales son coherentes, y sugieren una retroalimentación negativa entre RhoprOKA y la ecdisona; la ecdisona estimula la síntesis de RhoprOKA, lo que a su vez disminuye los niveles circulantes de ecdisona. Los ensayos in vitro con péptidos sintéticos mostraron que RhoprOKA produjo una disminución en el nivel de expresión de EH y CZ, coincidente con lo observado en los ensayos de silenciamiento transcripcional. Se observó además una disminución en la 6 expresión de RhoprCZ con la adición al medio de RhoprOKB, lo cual es coincidente con resultados obtenidos mediante silenciamiento transcripcional. En base a todos los resultados obtenidos en el trabajo, en conjunto con antecedentes bibliográficos para otras especies, se sugirió el primer modelo de regulación endócrina del proceso de muda para un insecto hemimetábolo, incluyendo a los cuatros principales neuropéptidos conocidos como reguladores de la muda en insectos holometábolos (ETH, EH, CCAP y CZ), junto con ecdisteroides y orcokininas. El trabajo de Tesis presentado representa un aporte en la comprensión de la regulación hormonal del proceso de ecdisis en el insecto hemimetábolo R. prolixus, y aporta por primera vez evidencia en cuanto al papel central de los neuropéptidos orcokinina en la regulación de la muda en insectos. Se presenta por primera vez un análisis integral de la función de neuropéptidos reguladores de la ecdisis en un insecto hemimetábolo. Los resultados son relevantes dentro del campo de la entomología básica, y tienen potencial aplicación en el desarrollo de estrategias de control de plagas de insectos basadas en blancos endócrinos.

In Argentina there are approximately 2,300,000 infected with Chagas. The control of the insect vector continues to be the most viable option as control and prevention of the disease. In the last two decades, the existence of triatomine populations resistant to insecticides (Triatoma infestans) was detected in the provinces of Chaco and Salta, and in the south of Bolivia. This represents a serious risk for the control of Chagas disease in Argentina and the region. The present work uses as a model organism the triatomine R. prolixus. This insect has a series of favorable characteristics for its use as a model in insect physiology: it is the second most important vector of Chagas disease; has favorable characteristics for its breeding; its genomic sequence is known; the results obtained in R. prolixus can potentially be applied to other triatomines, in even other insects. Particularly, for studies of post-embryonic development such as those carried out in this work, an advantage of the model is that the molting cycle is triggered in a predictable manner after the ingestion of blood, which allows the experiments to be synchronized. This thesis work falls within the framework of achieving alternatives to control harmful insects that are more efficient, selective and safe for the environment with respect to the neurotoxic insecticides in use. In this sense, we study the neuropeptides, peptide hormones that regulate all vital processes in multicellular organisms. The study of these molecules has potential applicability for the design of insecticides. It could allow the design of pseudo-peptides or peptide-mimetics capable of interfering with the physiology of insects of sanitary or economic importance, constituting a novel route towards obtaining new insecticides. Among the results achieved in the work, in the first place, a new isoform of the Orcokinins gene was identified, coding for a precursor of neuropeptides in R. prolixus. This isoform, called Orcokinin C was not identified until now in any other insect species. Its sequence, its molecular structure and the mature peptides generated by proteolytic cleavage were determined. 8 On the other hand, the tissue expression pattern of the three isoforms of the Orcokinin gene in R. prolixus (RhoprOKA, RhoprOKB and RhoprOKC) was determined. The expression pattern of RhoprOKA in peripheral tissues and for RhoprOKB in the central nervous system and peripheral tissues was completed by immunohistochemistry. It was found that both isoforms are expressed in gonads, and that RhoprOKB is also present in the midgut. RhoprOKC was detected only in the midgut through RT-qPCR. On the other hand, the pattern of temporal expression of RhoprOKA and RhoprOKB was determined throughout the molting cycle in fourth-stage nymphs. It was observed that both OKA and OKB increase their expression towards the end of the 12 day PBM moult cycle, which is a first indication of their role in the process of ecdysis, confirmed during the work by other approaches. The relationship of the OKs with the synthesis of ecdisteroides was evaluated by means of two experimental approaches: quantitative analysis of the expression of "reporter genes" linked to changes in the concentration of ecdisteroides; and direct measurement of the hemocelic concentration of ecdysteroids by competitive ELISA. Taken together these results, point to an ecdysteroid-static role for the RhoprOKA isoform. The role of RhoprOKs was studied by means of gene silencing mediated by RNA interference. The results confirmed a central role of RhoprOKA in the regulation of ecdysis, and a possible contributory role of RhoprOKB in this process. Insects expressing significantly reduced levels of RhoprOKA were unable to complete a successful ecdysis. The effect of RhoprOKs on the expression of other genes related to the process of ecdysis was studied. The silencing of this gene in fourth-stage nymphs correlated with a decrease in the level of expression of central neuropeptides in the regulation of the molting process (ETH: hormone triggering the ecdysis; EH: hatching hormone; CZ: corazonin and CCAP: peptide cardio-accelerator of crustaceans), measured on day 11 PBM (approximately 1-2 days pre-ecdysis). It was observed that the silencing of the RhoprOKA isoform produces a decrease in the expression of the RhoprETH and RhoprCCAP genes, as well as an increase in the expression of RhoprEH and RhoprCZ. This increase was confirmed on two different days of the molting cycle: day 6 post 9 intake (during the ecdysone peak) and day 11 PBM (just before the ecdysis) The silencing of the RhoprOKB isoform produced a more restricted effect on the expression of other genes: a decrease in RhoprCCAP on day and an increase in RhoprCZ on day 11 PBM. The expression of the RhoprETH, RhoprEH and RhoprCZ transcripts was also determined in 4th nymph throughout the moult cycle. An increase in the level of expression was observed on days 6, 10 and 12 PBM for RhoprETH an increase in the level of expression on days 10 12 PBM to RhoprEH and an increase in the level of expression on day 12 PBM for RhoprCZ. It is the first time that this type of analysis is carried out in a hemimetabolous insect. The expression patterns coincide with that reported in the literature for holometabola species. The expression of the RhoprETH, RhoprEH and RhoprCZ genes was silenced by interference RNA. The results suggest that these neuropeptides form a regulatory network for ecdysis, in a similar way to that reported for holometabola species. It is the first work in performing this type of analysis in hemimetabolous. The results suggest that RhoprCZ stimulates the synthesis of RhoprETH (as it happens in Lepidoptera). There is, on the other hand, a cycle of positive regulation between RhoprETH and RhoprEH, also observed in holometabola species with the exception of D. melanogaster. Finally, ETH regulates the expression of RhoprCCAP, and RhoprOKA and RhoprOKB. An in vitro preparation was used to study the interaction between Orcokinins, ecdysone and neuropeptides associated with the regulation of ecdysis. The results indicate that ecdysone, under certain physiological conditions, would stimulate the synthesis of the RhoprOKA isoform, which in turn would repress the expression of the RhoprCZ, RhoprETH, RhoprEH, RhoprCCAP genes and the RhoprOKB isoform. Altogether, the results obtained by different experimental approaches are coherent, and suggest a negative feedback between RhoprOKA and ecdysone: ecdysone stimulates the synthesis of RhoprOKA, which in turn decreases the circulating levels of ecdysone. In vitro tests with synthetic peptides showed that RhoprOKA produced a decrease in the level of expression of EH and CZ, coinciding with that observed in the gene silencing assays. A decrease in the expression of RhoprCZ was also observed for 10 the addition of RhoprOKB to the medium, which is coincident with results obtained by gene silencing. Based on all the results obtained in the work, together with bibliographic data for other species, the first model of endocrine regulation of the molting process for a hemimetabolous insect was proposed, including the four main neuropeptides known as moulting regulators in holometabolous insects (ETH, EH, CCAP and CZ), along with ecdisteroides and orcokininas. The presented thesis work represents a contribution in the understanding of the hormonal regulation of the process of ecdysis in the insect hemimetabolous R. prolixus, and provides for the first time evidence regarding the central role of the neuropeptide Orcokinina in the regulation of the moult in insects. We present for the first time an integral analysis of the function of neuropeptides that regulate ecdysis in a hemimethabolous insect. The results are relevant within the field of basic entomology, and have potential application in the development of insect pest control strategies based on endocrine targets.