Nanovesículas arqueolípidicas para targeting activo de agentes antiinflamatorios y antibioticos a macrófagos

Abstract

ResumenInicialmente, este trabajo de Tesis doctoral se orientó a aislar y purificar arqueolipidos polares totales (APT) de la membrana celular de la arquebacteria Halorubrum tebenquichense. A tal fin se puso a punto un protocolo, que consistió en el fraccionamiento de la mezcla de APT mediante cromatografía en columna con Silica 60. Esta técnica permitió obtener fracciones enriquecidas en los lípidos manosilados SDGD-5 y SGDG-5PA, y en el fosfolípido PGP-Me. Luego, con cada una de estas fracciones arqueolipidicas se prepararon dos tipos de nanovesiculas: unas enriquecidos en cada una de estas fracciones, otras combinando cada una de dichas fracciones con fosfolípidos de soja. Las nanovesiculas se prepararon por el método de resuspensión de la película lipídica, que luego se homogeneizaron mediante sonicación y extrusión, hasta lograr tamaños promedios entre 100 y 200 nm medidos por dispersión dinámica de la luz. Nuestra hipótesis inicial fue que el enriquecimiento de nanovesiculas en glicoarqueolipidos como SDGD-5 y SGDG-5PA, aumentaría la extensión de su captura celular, y de esta forma podrían usarse como poderosos agentes de delivery intracelular de drogas. Para verificarlo, se determinó la captura de cada uno de estas nanovesiculas, por macrófagos cultivados in vitro. A tal fin, se analizó mediante citometría de flujo la internalización celular por la línea de macrófagos J774A.1, de los diferentes tipos de nanovesiculas marcados con el fluoroforo de membrana RhPE. Sorprendentemente, observamos que los nanovesiculas enriquecidas en glicoarqueolipidos (y carentes de PGP-Me) se capturaron en muy baja extensión, en tanto aquellas enriquecidos en PGP-Me (y carentes de glicoarqueolipidos), o los preparados con arqueolípidos sin fraccionar (APT; nanovesiculas conocidas como arqueosomas [ARQ], conteniendo PGP-Me y glicoarqueolípidos), fueron los más extensamente capturadas. Se concluyo que fue el PGP-Me y no los glicoarqueolipidos los que jugaron un rol clave en la extensión de captura por macrófagos. Para elucidar el mecanismo responsable, se llevó a cabo un ensayo de competición de captura por células J774A.1. A tal fin, ARQ marcados con RhPE se incubaron con células J774A.1, en presencia o ausencia de competidores de captura y su internalización se determinó por citometría de flujo. Como competidores de captura, se utilizaron ligandos conocidos de receptores de membrana, involucrados en mecanismos de captura endocitica, a saber: ácido poli-inosinico (ligando de receptores scavenger clase A), fosfatidilserina (ligando de receptores scavenger clase B), y un polisacárido de manosa (ligando del receptor de manosa). Observamos que la captura se vio inhibida en un 80 ± 20%, únicamente en presencia de ácido poliinosinico. Se concluyó entonces que los ARQ (o nanovesiculas conteniendo APT) fueron los más extensamente endocitados, principalmente mediante receptores scavenger clase A. Por esta razón en esta Tesis empleamos nanovesiculas preparadas en base a APT, ya como arqueosomas (únicamente APT) o combinados con otros lípidos. En segundo lugar, se exploró la citotoxicidad de ARQ sobre macrófagos por distintos métodos, a saber: MTT, LDH y apoptosis/necrosis mediante microscopia de fluorescencia con Ioduro de propidio, Hoeschst y YO-PRO y ensayo del TUNEL. Supimos que hasta un valor de 100 µg/ml los ARQ no afectan la viabilidad celular, ni la estructura de la membrana plasmática, aunque podrían al cabo de 24 h, inducir apoptosis sobre una fracción de esta línea celular. Los detalles experimentales y resultados hasta aquí descriptos se discuten extensamente en el Capítulo 2. En el Capítulo 3, se presentó el diseño de nanovesiculas capaces de aumentar la extensión del delivery citoplásmico respecto del provisto por ARQ o nanovesículas fosfolipidicas ordinarias. Para esto modificamos la estructura de ARQ, tal que fueran capaces de responder a cambios de pH: consideramos que una vez endocitados, la disminución de pH ofrecida por el interior endosomal gatillaría una transición de fase responsable del vuelco de su contenido interno al citoplasma. Partiendo entonces de la matriz pH sensible DOPE:CHEMS 7:3:0 (LpH) a la que se le incorporaron cantidades crecientes de APT, nació el diseño de los llamados arqueosomas pH sensibles. Para evaluar la pH sensibilidad de estas formulaciones frente a la acidez, el par fluoroforo quencher HPTS-DPX fue incorporado a su interior acuoso. Primeramente, se evaluó la pH sensibilidad de los distintos nanovesiculas en ausencia de células. Para ello, se las incubo por 10 minutos a 37°C a distintos pH y luego se midio la intensidad de fluorescencia del HPTS dequencheado, liberado al ocurrir la transición de fase y desestabilización de la membrana nanovesicular. Hallamos que a pH 4,5 la formulación conteniendo DOPE y CHEMS LpHa liberó 50 % de su contenido acuoso. Hallamos además que dicho porcentaje decreció a medida que las formulaciones aumentaban su proporción de APT, hasta ser nulo para los ARQ. Esto significo que los ARQ son completamente pH-insensibles, en tanto que pudieron obtenerse formulaciones pH-sensibles conteniendo una fracción relativamente pequeña de APT. El siguiente paso fue evaluar la capacidad de las distintas formulaciones para ejecutar delivery citoplásmico sobre varias líneas celulares: J774A.1, NR8383 (macrófagos alveolares de rata) y A549 (neumocitos tipo II humanos). Para esto se utilizaron nanovesiculas con doble marca, RhPE y HPTS-DPX. De esta forma se pudo evaluar, por un lado, la cantidad de contenido acuoso liberado al citoplasma por cada nanovesicula, y por otro la extensión de su captura (ya que aquellas formulaciones con baja proporción de APT podían ser menos capturadas). Así determinamos que los nanovesiculas ApH3, formulación pH sensible con mayor proporción de APT, proporcionaron la máxima cantidad de HPTS citoplásmico. El máximo delivery citoplásmico en este caso resulto de la combinación única de una elevada tasa de captura con una relativa pHsensibilidad. Las nanovesiculas ordinarias (no pH sensibles) no son herramientas útiles para entregar drogas hidrosolubles al citoplasma celular: luego de ser endocitadas, su contenido acuoso queda atrapado en el interior endo-lisosomal, resultando inaccesible al citoplasma celular. Por el contrario, una de las importantes prestaciones de nanovesiculas como ApH3, radica en su capacidad para ofrecer delivery masivo de drogas hidrosolubles al citoplasma celular. Tal es el caso de la forma hidrofílica del anti-inflamatorio dexametasona fosfato (DEX-P) cuya acción depende de la unión al receptor de glucocorticoide citoplasmático. DEX-P fue incorporada al interior acuoso de distintos nanovesiculas- incluyendo ApH3- y se evaluó su citotoxicidad sobre las líneas celulares J774A.1, macrófagos THP-1 (macrófagos transformados a partir de monocitos humanos) y A549. Hallamos que ninguna formulación afecto la viabilidad celular hasta concentraciones 10 µg/ml de DEX-P y 50 µg de LT luego de 24 horas de incubación con J774 y THP1, mientras que en células A549 la viabilidad no disminuyó hasta 50 µg/ml DEX-P y 250 µg/ml de LT. En estas mismas líneas celulares se evaluó la actividad anti-inflamatoria de DEX-P incorporada en distintas nanovesiculas - incluyendo ApH3-, luego de co-incubar y pre incubar las células con LPS o PMA y medir la liberación de citoquinas pro-inflamatorias mediante Elisa de captura. Hallamos que ApH3-DEX-P indujo la máxima disminución de liberación de TNF-α e IL-6 por células J774A.1. En células A549, observamos que solo disminuyo significativamente la liberación de IL-6, sin diferencias significativas entre muestras. En células THP-1 finalmente, determinamos que tanto nanovesiculas vacías como conteniendo DEX-P disminuyeron la liberación de TNF-α, IL-1β e IL-6 más pronunciadamente que DEX-P libre. También se testeó la actividad anti-inflamatoria de nanovesiculas-DEX-P midiendo su capacidad para inhibir la generación de especies reactivas de oxigeno (ERO). Para ello se cuantificó la intensidad de fluorescencia generada por la sonda DCFDA, luego de ser incubada durante 24 horas con células J774A.1 o THP-1 activadas con LPS en presencia o ausencia de nanovesiculas, mediante un equipo Cytation 5. DCFDA es una molécula que una vez endocitada se desacetila y en presencia de ERO se oxida a una forma fluorescente. Así, determinamos que ApH3 produjo una disminución de ERO significativamente mayor que con LpH o DEX-P libre. El conjunto de estos resultados permite sugerir que los ApH3 constituyen una herramienta eficaz para aumentar el delivery citoplásmico de DEX-P -y por ende su actividad anti-inflamatoria- en cultivos celulares in vitro. Por otra parte, se evaluó la estabilidad coloidal de los distintas nanovesiculas (con y sin APT) luego de almacenados durante tres y seis meses a 4°C. Hallamos que todas las formulaciones mantuvieron tamaños en el orden de los 200 nm con índices de polidispersidad menores a 0,4. Luego, determinamos su capacidad (fundamentalmente de LpH [formulación ph sensible y carente de arqueolípidos] y de ApH3) para resistir el estrés de nebulización. La técnica de nebulización elegida fue la de malla vibradora, que permite formar microgotas de tamaño de 2 a 4 micrones, facilitando su acceso a los alveolos donde los macrófagos allí residentes juegan un rol clave en el establecimiento de procesos inflamatorios pulmonares. Se determinaron así los cambios en tamaño, concentración de lípidos y liberación de HPTS antes y después de la nebulización de las suspensiones nanovesiculares, luego de recolectarlas en un balón conectado al nebulizador. Hallamos que tras nebulizadas, ApH3 y LpH mantuvieron sus tamaños. Sin embargo, mientras que de las nanovesiculas ApH3 nebulizadas se recuperó el 70% del HPTS encapsulado, para LpH solo se recuperó el 50%. Esta diferencia es aún mayor al nebulizar nanovesiculas almacenados durante seis meses; mientras que ApH3 mantuvo su performance, la cantidad de nanovesiculas LpH nebulizadas estuvo por debajo del límite de detección. La determinación de su performance como agente de delivery citoplásmico de drogas antiinflamatorios estructuralmente resistente al estrés de nebulización, fue complementada con el estudio de su interacción con el surfactante pulmonar (SP). El SP recubre el epitelio alveolar y debe ser atravesado por toda nanovesicula nebulizada antes de contactar las células (macrófagos o células epiteliales alveolares) subyacentes. A tal fin se trabajó en conjunto con el grupo de Biofísica del CIBAAL de la Universidad de Santiago del Estero. En el Capítulo 4 se describe la preparación de monocapas de SP en balanza de Langmuir. Se determinó a continuación si ARQ, L, LpH y ApH inyectados o nebulizados a la interfase acuosa en distintas condiciones de compresión, perturbaban la presión superficial de SP a lo largo de ciclos dinámicos de compresión-expansión del SP, en un intento de simular la dinámica respiratoria. Hallamos que las formulaciones ApH3 no solo no indujeron inactivación de surfactante, sino que hasta conseguían mejorar su función reductora de tensión superficial. Además, observamos que nebulizados sobre células cubiertas con SP, su extensión captura y subsiguiente capacidad de delivery citoplásmico se mantenían prácticamente intactas. En el Capítulo 5, la actividad de nanovesiculas preparadas en base a APT como agentes antiinflamatorios nebulizables, derivo en otra potencial aplicación terapéutica: su uso como agente antimicrobiano. En este caso, buscamos aumentar el delivery al sistema endo-lisosomal (sitio donde residen ciertos agentes infecciosos pulmonares), y en paralelo, aumentar el acceso a biofilms formados por bacterias que colonizan las vías respiratorias superiores. Así, el antibiótico ácido lábil azitromicina (AZ) fue incorporado en la formulaciones nanovesiculares no pH sensibles ARQ y L. Se determino su citotoxicidad sobre células THP-1 convertidas a macrófagos y sobre células A549. Observamos que la estabilidad de las nanovesiculas ARQ-AZ frente a nebulización fue muy superior a las del resto. Medimos la actividad antibacteriana de las distintas formulaciones sobre biofilms de Staphylococcus aureus. Los resultados preliminares mostraron que AZ mantuvo su efecto antimicrobiano aun incorporada en las nanovesiculas.En el Capítulo 6 por último, una única aplicación ajena a nebulización de las nanovesiculas preparadas en base a APT, busco explotar la combinación de su elevado potencial Z negativo con su naturaleza estructural responsable de alta estabilidad frente al almacenamiento. Dada su capacidad de disminuir la actividad de la enzima fosfolipasa A2 (PLA2), hipotetizamos aquí que los ARQ tendrían un rol como agentes antivenenos, complementario al uso de sueros antiofídicos. La PLA2 es un componente enzimático de venenos de Bothrops responsable de generar intermediarios de inflamación, dolor, hemolisis y mionecrosis. Se llevaron a cabo ensayos preliminares de inhibición de actividad de venenos de yarará sobre cultivos celulares de fibroblastos (L20B) y células musculares (RD), células target de los venenos, en donde se demostró que ARQ de tamaños > 200 nm a una concentración de 50 mg/mL lograron inhibir la actividad citotóxica del veneno de la serpiente Bothrops neuwidi diporus.