Evolución del virus de hepatitis B: Análisis de mecanismos involucrados en el establecimiento y progresión de la infección viral

Abstract

El virus de hepatitis B (HBV), debido a su estructura poblacional de cuasiespecie, circula como un conjunto de variantes genéticamente relacionadas que evolucionan a lo largo de la infección crónica. La evolución de la población viral, ya sea en la infección en un mismo paciente o en una población de individuos, resulta de un complejo equilibrio entre diversas subpoblaciones virales que dependiente tanto de factores virales como del hospedador. Como resultado del proceso evolutivo, se fijan aquellas subpoblaciones virales que presenten el mayor fitness para cada situación particular durante la infección crónica. La fijación de las subpoblaciones virales durante el proceso de la infección crónica por HBV podría estar mediada, en parte, por una ventaja relativa de su capacidad replicativa a nivel celular (fitness replicativo). Para evaluar esta hipótesis se desarrolló una metodología que permite cuantificar dicha ventaja replicativa. A partir de la cotransfeccion con las variantes a evaluar se determina la frecuencia relativa de las mismas por clonado y posterior análisis por RFLP de la progenie viral. Esta determinación fue utilizada para el análisis de dos situaciones evolutivas: a.- la evolución intrahospedador en la infección crónica (seroconversión/fijación de mutantes) y b.- la evolución interhospedador (la ocupación del nicho ecológico /prevalencia de (sub)genotipos). Respecto a la evolución intrahospedador ha sido recientemente informado (Sede et al. (2014) la coexistencia de tres subpoblaciones variantes (sgtD1cs, sgtD1del y sgtD1mut), durante cinco años de estudio de un paciente infectado crónicamente. La frecuencia relativa de las subpoblaciones se mantuvo estable a lo largo del proceso de seroconversión, permaneciendo la sgtD1del predominante durante todo el período. Esta observación no pudo ser explicada por el análisis del fitness replicativo desde que sgtD1del presenta un valor significativamente menor al ser comparada tanto con sgtD1cs como con sgtD1mut. Con el fin de comprender los resultados del fitness replicativo se evaluaron los niveles de ADN extracelular, de intermediarios replicativos y de HBeAg y HBsAg en transfecciones con cada variante y en cotransfecciones con dos variantes a evaluar. Los resultados muestran que los niveles de ADN extracelular y también la síntesis de intermediarios replicativos intracelulares de sgtD1del, fue menor comparando con los observados para las sgtD1cs y sgtD1 mut. Esta menor capacidad replicativa de la subpoblación sgtD1del está de acuerdo con su menor fitness replicativo observado anteriormente. Además, al comparar los niveles de ADN en los experimentos de cotransfección sgtD1cs vs sgtD1del y sgtD1mut vs sgtD1del, notamos que la mezcla no se comporta de la misma manera en estos dos ensayos. En la cotransfección de sgtD1del con sgtD1cs se observan valores similares a los obtenidos en la transfección con sgtD1cs, mientras que en la cotransfección con sgtD1mut los valores son similares a los obtenidos en la transfección con sgtD1del. Esta diferencia es observable tanto en los niveles de ADN extracelular como intracelular. Esta observación constituye la primera evidencia del impacto biológico que resulta de la interacción entre diversos genomas replicándose en una misma célula. Hay diversas interacciones que estas variantes pueden tener en estas condiciones que podrían modificar su comportamiento y que no se detectarían en las transfecciones de estas variantes por separado. Los resultados presentados demuestran que la variante sgtD1del tiene menor fitness replicativo que sgtD1cs y sgtD1mut, por lo cual no puede explicar por sí mismo el comportamiento informado en el paciente. Sin embargo, el nivel de replicación a nivel celular no es el único factor que determina la selección de una variante viral específica in vivo. Otros factores, como la presión selectiva del sistema inmunológico, podrían explicar esta diferencia observada.En un estudio reciente, donde se estimó la prevalencia de sgts en infecciones agudas y crónicas HBeAg positivas en Argentina, se observó una mayor prevalencia del sgtF1b seguido por sgtA2, sgtF4 y sgtD (Ledesma et al. 2015). Los análisis realizados en este trabajo mostraron el mismo fitness replicativo entre todas las combinaciones de subgenotipos, con la excepción de la cotransfeccion con sgtF1b-sgtF4, que presento en la progenie un aumento de sgtF1b a expensas de sgtF4. Además, cuando se simularon ciclos seriales de infección, pudo observarse que la relación entre sgtF1b y sgtF4 se incrementó en la dirección del predominio del sgtF1b. Este resultado está en línea con la observada alta prevalencia del sgtF1b. Con el fin de analizar las diferencias observadas en los experimentos de fitness replicativo se evaluaron los niveles de ADN extracelular, de intermediarios replicativos y de HBeAg y HBsAg. Los resultados mostraron que sgtF1b presenta niveles significativamente más altos tanto de ADN extracelular como de intermediarios replicativos. También notamos que, aunque sgtF4 tiene un nivel de replicación más bajo, tiene una expresión de HBeAg significativamente más alta. El ARN pre-genómico y el ARNm pre-núcleo (precursor de HBeAg), se transcriben desde el mismo ORF (preC/C) pero los promotores utilizados en su síntesis son genéticamente distintos y regulados separadamente. Teniendo esto en cuenta, este resultado podría sugerirque una de las diferencias intrínsecas entre sgtF1b y sgtF4 es la regulación de síntesis de estos dos ARNm. Mientras que el sgtF4 parece favorecer la síntesis de HBeAg, el sgtF1b favorecería la síntesis del pregenoma. Esta preferencia por la síntesis del genoma podría ser una de las explicaciones por las cuales el sgtF1b está ocupando el nicho ecológico de las nuevas infecciones en Argentina. En resumen, se presenta un nuevo método destinado a evaluar el fitness replicativo del HBV. Este método permitirá profundizar el análisis de las interacciones entre diferentes variantes virales y contribuirá a la mejor comprensión de los mecanismos de selección que rigen las infecciones por el HBV. La cotransfección con sgtD1del y sgtD1mut constituye la primera evidencia del impacto en la replicación del HBV cuando dos variantes virales se replican simultáneamente en el mismo sistema celular.