Evaluación de la potencialidad de la lechuga como plataforma para el mejoramiento de especies asteráceas. Análisis de la respuesta de plantas sobreexpresantes del péptido antimicrobiano Snakin-1 frente a estreses bióticos y abióticos

Abstract

La lechuga (Lactuca sativa L.) es una de las hortalizas más consumidas a nivel mundial. En Argentina se produce en casi todo el país, en los cinturones verdes de las grandes ciudades. Su sistema de producción es descentralizado, requiere mucha mano de obra y se realiza durante todo el año gracias al cultivo bajo cubierta. Por estas características es el cultivo más utilizado en la Agricultura Familiar. Se consumen las hojas frescas, por lo que es una hortaliza perecedera de baja competitividad, que no puede ser almacenada o transportada durante largos períodos de tiempo, estando los centros de producción a corta distancia de los lugares de consumo. Su producción es intensiva, se realiza tres o cuatro veces al año en el mismo sitio, lo que facilita la aparición de plagas y enfermedades. Las enfermedades foliares, principalmente las de origen fúngico, reducen la producción y afectan severamente el valor comercial del cultivo. El intento de controlar a estos patógenos suele llevar a un abuso en la aplicación de agroquímicos, lo que conduce a un alto impacto ambiental, mayores costos y un alto riesgo sanitario de exceder los niveles permitidos de estas sustancias en los productos cosechados.La lechuga es una especie modelo en biotecnología, dada su buena respuesta al cultivo de tejidos y al desarrollo de un sistema de transformación estable que ha permitido la introducción de diversos genes en el cultivo, y ha sido propuesta como el sistema modelo de transformación genética del grupo taxonómico Asteraceae.Snakin-1, péptido antimicrobiano aislado de papa, ha demostrado su actividad antimicrobiana de amplio espectro in vitro e in vivo, tanto en el sistema homólogo papa como en sistemas heterólogos.En este contexto, y con el objetivo de evaluar la potencialidad de la lechuga como sistema modelo para ensayar la obtención de plantas resistentes a patógenos mediante su transformación con genes antimicrobianos heterólogos, se evaluó si la sobreexpresión de Snakin-1 era capaz de conferir tolerancia y/o resistencia a patógenos en plantas transgénicas de lechuga.En este trabajo, se llevaron a homocigosis cinco eventos de transformación portando los genes snakin-1 y nptII y se caracterizaron molecular y biológicamente. La presencia y la estabilidad de la construcción génica fue confirmada por un análisis de Southern blot en la filial T3 y mediante la observación del fenotipo de resistencia a kanamicina hasta la filial T5. El nivel de expresión de snakin-1 en cada línea se determinó mediante ensayos de RT-qPCR y Western blot.Las líneas transgénicas, en comparación con las no transgénicas tuvieron semillas de mayor tamaño, una elongación más lenta de la radícula durante la germinación y hojas con mayor índice de circularidad. En algunas líneas los tallos presentaron un mayor grosor y una menor elongación, produciendo plantas más compactas. En algunas líneas transgénicas se detectó una menor acumulación de ROS. También, se detectaron diferencias entre las líneas transgénicas y la línea no transgénica bajo estrés térmico, tanto en la germinación de las semillas como en la elongación de las plantas adultas.Los desafíos con fitopatógenos se realizaron con los hongos Rhizoctonia solani y Sclerotinia sclerotiorum. En ensayos in vitro en placas conteniendo extracto proteico de plantas transgénicas, se registró una inhibición del crecimiento de R. solani, demostrando que el extracto crudo de planta transgénica pudo reducir el crecimiento del hongo en forma directa, por acción del péptido Snakin-1. Por otro lado, las líneas con mayor sobreexpresión del transcripto snakin-1, demostraron una mejor respuesta en el desafío in vivo frente a R. solani, tanto en ensayos con plántulas in vitro como en plantas en invernáculo. También, dos de esas mismas líneas mostraron una protección significativa frente a S. sclerotiorum en ensayos de desafío en plantas adultas.Se pudo identificar una línea (2.2B) con buena respuesta a estrés biótico y abiótico.Nuestros resultados muestran la actividad de amplio espectro del péptido antimicrobiano Snakin-1 en lechuga, tanto in vitro como in vivo, dependiente del nivel de expresión del transgén. Esto refleja tanto la capacidad biotecnológica del péptido Snakin-1 como la utilidad de la lechuga como planta modelo dentro de la familia Asteraceae para la evaluación de genes de interés agronómico.

Lettuce (Lactuca sativa L.) is one of the most consumed vegetables worldwide. In Argentina, it is produced all along the country, especially around big cities. Its production system is decentralized, it requires a lot of labor and it is performed during all year through greenhouse growing. These characteristics make lettuce the most used crop in family farming. The fresh leaves are consumed, so it is a very perishable vegetable of low competitiveness, which cannot be stored or transported during long periods of time, being grown where distances between production and consumption centers are short. Such intensive production, three or four times a year in the same place, makes lettuce susceptible to economically important plagues and diseases. Foliar diseases, especially those of fungal origin, can reduce production and severely affect the commercial value of this crop. The attempt to control these pathogens usually leads to an excessive use of agrochemicals, which results in an environmental impact, higher costs and the risk of exceeding the permitted levels of these substances in the harvested products. Lettuce is a model specie for biotechnology research, since explants are very responsive to tissue culture conditions and a stable transformation system has been developed for this crop and has been proposed as model plant for genetic transformation within the Asteraceae taxonomic group. Snakin-1, an antimicrobial peptide isolated from potato, has demonstrated in vivo and in vitro broad-spectrum antimicrobial activity, both in the homologous system potato and in heterologous systems. In this context, and in order to evaluate the potential of lettuce as a model system for testing the obtaining of pathogen-resistant plants by its transformation with heterologous antimicrobial genes, we examined if overexpression of Snakin-1 was capable of conferring tolerance and/or resistance to pathogens in transgenic lettuce plants. In this work, five transformation events carrying the snakin-1 and nptII genes were taken to homozygosis and molecular and biologically characterized. The presence and stability of the gene construct was confirmed by Southern blot analysis in the T3 and by observing the phenotype of kanamycin resistance till the T5 progeny. The expression level of Snakin-1 in each line was determined by RT-qPCR assays and Western blot. Transgenic lines, compared with non-transgenic lines, had larger seeds, a slower radicle elongation during germination and leaves with greater circularity index. In some lines it was observed a greater thickness and a smaller elongation of the stem, producing more compact plants. In some transgenic lines, a lower concentration of ROS was observed. Also, some differences were evaluated between the transgenic lines and the non-transgenic line under thermal stress, both in seed germination as well as in the elongation rate of adult plants. Evaluation of lines against phytopathogenic fungi, were performed with Rhizoctonia solani and Sclerotinia sclerotiorum. In in vitro assays on plates containing protein extract of transgenic plants, the inhibition of growth of the fungus R. solani was recorded, showing that the crude transgenic plant extract could reduce the growth of the fungus directly, by action of the peptide Snakin-1. Furthermore, lines with the greatest overexpression of Snakin-1 transcript, showed a better response in the in vivo challenge against R. solani both in chamber and in greenhouse experiments. Also, two of these lines showed significant protection against the pathogen S. sclerotiorum in challenge assays on adult plants. It was possible to identify one line (2.2B) with good response to biotic and abiotic stresses. Our results show the broad spectrum activity of the antimicrobial peptide Snakin-1 in lettuce, both in vitro and in vivo, dependent on the level of transgene expression. This reflects both the biotechnology capacity of the Snakin-1 peptide as well as the utility of lettuce as a model plant in the Asteraceae family for assessing genes of agronomic interest.