Efecto de análogos sintéticos de vasopresina sobre tumores con características neuroendócrinas

Abstract

Los tumores neuroendocrinos (TNE) comprenden un grupo heterogéneo de neoplasias malignas que presentan una amplia gama de características morfológicas, funcionales y comportamentales. El concepto de diferenciación neuroendocrina (NE) puede definirse como la secreción de sustancias bioactivas por las células neoplásicas. El crecimiento de TNE está regulado principalmente por señalización autócrina y parácrina a través de neuropéptidos, hormonas peptídicas y bioaminas con acciones fisiológicas definidas, estas vías de señalización dependen de la expresión de receptores específicos en las células tumorales. Las principales proteínas expresadas por estos tumores son la sinaptofisina, la cromogranina A (CgA) y la enolasa neuronal específica (NSE), entre otras. La CgA es el biomarcador más utilizado para detectar la diferenciación NE en el cáncer de próstata ya sea a nivel tisular o en la circulación general. La NSE es actualmente el marcador tumoral más confiable en el diagnóstico, el pronóstico y el seguimiento del cáncer de pulmón de células pequeñas (SCLC). La diferenciación NE de los tumores ha sido relacionada con la transición de las células cancerosas con características epiteliales hacia células con fenotipos invasivos y metastásicos (transición epitelio mensenquimal, TEM). En algunos tipos de cáncer, como el cáncer de próstata, también se ha vinculado la diferenciación NE con la transición de un tumor hormono dependiente hacia un tumor hormono-independiente contribuyendo esta transdiferenciación con la progresión tumoral, la resistencia hormonal y con un pronóstico desfavorable. Además, en cáncer de pulmón, la transformación de nSCLC a SCLC se asocia con mala respuesta al tratamiento y aumento de NSE en suero. Una reducción de la expresión de los marcadores NE podría indicar desdiferenciación NE. La vasopresina (AVP) es un neuropéptido con efecto endócrino, parácrino y autócrino en tejidos normales y patológicos. Los receptores AVP están presentes en diferentes tipos de cáncer, como cáncer de pulmón, de mama, pancreático, colorrecal y gastrointentinal, con efectos contrastantes sobre el crecimiento tumoral dependiendo del subtipo del receptor. Mientras que los receptores de AVP de tipo 1 (V1a y V1b) están asociados con la estimulación de la proliferación celular, el receptor de AVP de tipo 2 (V2r) está relacionado con efectos antiproliferativos. La desmopresina (dDAVP) es un análogo sintético de AVP que actúa como un agonista selectivo para el V2r, que ha mostrado propiedades antitumorales en modelos de cáncer de mama y colorrectal.El desarrollo de medicamentos cada vez más seguros, adecuados y eficaces para el tratamiento de enfermedades es una tarea que requiere la interacción de diferentes disciplinas. La identificación de secuencias de péptidos y el análisis de fuentes naturales es un enfoque ampliamente utilizado basado en una perspectiva evolutiva para la búsqueda de nuevos compuestos con aplicaciones terapéuticas. Por otra parte, el diseño racional de los fármacos basados en estudios de relaciones de estructura-actividad (SAR), constituye una herramienta indispensable en el desarrollo de nuevos medicamentos. El objetivo de la presente tesis doctoral fue desarrollar análogos de AVP diseñados mediante una aproximación racional y una evolutiva, y evaluar las propiedades antitumorales in vitro e in vivo de los análogos de AVP diseñados sobre líneas celulares con y sin características NE, incluyendo las siguientes líneas celulares: NCI-H82, agresiva de SCLC, NCI-H125, NSCLC (carcinoma escamoso de pulmón) y PC-3, cáncer de próstata.El primer método de diseño de fármacos utilizado consistió en aplicar un enfoque evolutivo explorando péptidos bioactivos de fuentes naturales, prestando especial atención a su actividad fisiológica específica. Esta estrategia basada en la evolución nos llevó a diseñar un nuevo análogo derivatizado a partir del péptido INT presente en escarabajos, denominado dDINT. El segundo enfoque explorado se basó en la realización de un estudio SAR utilizando la técnica de Ala-scanning sobre dDAVP como compuesto de primera generación para identificar las posiciones aminoacídicas claves implicadas en su actividad antiproliferativa sobre las células NCI-H82. Previamente a ésta exploración se identificó el blanco molecular V2r y la expresión de los marcadores NE, CgA y NSE, en las líneas estudiadas mostrando que las líneas NCI-H82 y PC-3 presentan V2r y expresan los marcadores NE, la línea NCI-H82 mostró un mayor expresión tanto del receptor como de los marcadores NE por lo que fue elegida para el ala scanning. Después de evaluar todos los derivados de dDAVP sustituidos con Ala, se demostró una estrecha relación entre la secuencia aminoacídica que pertenece al bucle conformacional de dDAVP y su actividad antiproliferativa. Como resultado, sintetizamos el nuevo análogo selectivo, [V4Q5] dDAVP, introduciendo valina y glutamina en las posiciones aminoacídicas 4 y 5, respectivamente. [V4Q5] dDAVP mostró interesantes efectos biológicos, mostrando un aumento de los efectos citostáticos en las células tumorales de SCLC en comparación con el compuesto parental dDAVP, así como también comparado con el análogo dDINT. Los análogos de AVP, dDAVP y [V4Q5] dDAVP, fueron evaluados preclínicamente in vitro, donde redujeron significativamente la proliferación, el tiempo de duplicación y la migración en ambos cultivos de células tumorales, NCI-H82 y PC-3 positivas para V2r. No tuvieron efecto sobre la línea celular que no presenta características NE y no expresa V2r NCI-H125. Ambos análogos tuvieron, además, un efecto que conduciría a una regulación pro-apoptótica de las células tumorales al regular la expresión de BAX y su par anti-apoptótico: Bcl-2 o Bcl-xL en las líneas de próstata y pulmón respectivamente. El análogo de segunda generación [V4Q5] dDAVP mostró un mayor efecto citostático que dDAVP sobre la proliferación celular en la línea celular NCI-H82. El silenciamiento de V2r usando ARN de interferencia atenuó significativamente los efectos inhibitorios de [V4Q5] dDAVP sobre la proliferación de células NCI-H82 así como también el bloqueo del receptor mediante un antagonista competitivo no peptídico mostró el mismo efecto, confirmando así que el nuevo análogo actúa principalmente vía V2r. Curiosamente, después del tratamiento con dDAVP, la expresión de ambos marcadores NE estudiados, CgA y NSE, se redujo en las líneas celulares de cáncer de pulmón y de próstata. En los pacientes con cáncer, los niveles elevados de CgA y NSE se correlacionan con carga tumoral, número de sitios de diseminación y falta de respuesta clínica, mientras que una disminución de estos biomarcadores podría indicar un mejor pronóstico. La capacidad de dDAVP para modular los marcadores NE en diferentes tipos de tumores constituye una contribución interesante e importante para estudios posteriores.Exploramos el efecto in vivo de dDAVP y [V4Q5] dDAVP en xenoinjertos de SCLC NCI-H82 y de carcinoma prostático agresivoPC-3. Los tumores tratados (0.3 μg/kg/día, tres veces por semana) crecieron más lentamente en comparación con los animales tratados con el vehículo en ambos modelos. También se observó una disminución de la angiogénesis in vivo en los tumores de SCLC tratados con dosis de 1 µg/kg/día de ambos análogos, mostrando de este modo el efecto antiangiogénico del compuesto. Tanto NCI-H82 como PC-3, representan modelos tumorales NE de resistencia a las terapias y enfermedad recurrente muy valiosos.Resumiendo, en esta tesis, hemos demostrado que el diseño racional basado en SAR es una buena herramienta para el diseño de agonistas específicos de V2r. Si bien el abordaje evolutivo en este trabajo no arrojó un análogo con propiedades antitumorales mejoradas, los abordajes evolutivos en combinación con estudios de SAR y estudios computacionales podrían proporcionar la base para futuros estudios de neuropéptidos para el desarrollo de nuevos y mejores análogos con potencial aplicación terapéutica, así como también, la reinterpretación fisiológica en humanos a partir del estudio evolutivo y la actividad fisiológica en otros animales podría contribuir al entendimiento de la enfermedad.Dada la agresividad de la enfermedad y la urgente necesidad de nuevos enfoques terapéuticos, los estudios realizados y los resultados obtenidos en esta tesis doctoral, en el modelo de SCLC humano: NCI-H82, y en el modelo de cáncer de próstata con rasgos NE: PC-3, constituyen el puntapié inicial para el desarrollo preclínico de éstos análogos de AVP, agonistas de V2r en éstos tipos de cáncer, representando hallazgos que no sólo contribuyen a la búsqueda de posibles terapias para TNE, sino que también, arrojan valiosos modelos de enfermedad de alta recurrencia y resistencia a fármacos.