Caracterización de enzimas activas sobre carbohidratos de un aislamento de Cellulomonas sp. para degradación de biomasa lignocelulósica

Abstract

La lignocelulosa es el componente mayoritario de la biomasa vegetal. Está formada por celulosa embebida en una matriz de hemicelulosa y lignina. Los microorganismos celulolíticos aerobios secretan un conjunto de enzimas que les permiten degradar los polisacáridos estructurales (celulosa y hemicelulosas) para utilizarlos como fuente de carbono. Estas enzimas son ampliamente estudiadas y tienen gran importancia, particularmente por su potencial aplicación en el aprovechamiento de biomasa noalimenticia, como residuos agro-foresto industriales, principalmente para obtener biocombustibles o alimento animal. El aislamiento bacteriano Cellulomonas sp. B6, obtenido a partir de un consorcio celulolítico de suelo forestal, fue capaz de crecer en numerosos sustratos celulósicos, incluyendo biomasa. Los sobrenadantes de cultivo presentaron principalmente actividades endo y exoglucanasa y xilanasa y en los extractos intracelulares se detectaron actividades β-glucosidasa y β-xilosidasa. El crecimiento en biomasa lignocelulósica (residuo de cosecha de caña de azúcar, RAC) resultó en la mayor actividad enzimática en el sobrenadante (0,2 y 0,6 UI/ml para las actividades endoglucanasa y xilanasa, respectivamente). Estas actividades se mantuvieron en un rango de pH de 5 a 8 y de temperatura de 40 a 55°C, indicando la potencialidad del extracto para aplicaciones de degradación de biomasa en esas condiciones. Por zimografía, estas actividades se correlacionaron con proteínas presentes en el sobrenadante de cultivo. El genoma de Cellulomonas sp. B6 fue secuenciado por Illumina MiSeq y ensamblado en 279 contigs, resultando en una cobertura de 83X. El tamaño total del genoma se estimó en 4 Mb y el contenido de GC fue de 75,1%, similar a lo reportado para cepas de referencia del género. Por análisis filogénetico a partir de la secuencia de la subunidad 16S de ARN ribosomal, Cellulomonas sp. B6 se encuentra relacionado con las especies Cellulomonas flavigena y Cellulomonas persica, aunque presenta características genotípicas y metabólicas distintivas, lo que sugiere que podría tratarse de una nueva especie. Mediante anotación del genoma Cellulomonas sp. B6 por las plataformas NCBI y RAST, seguido de análisis por la plataforma dbCAN, se identificaron 3443 secuencias codificantes para proteínas, de las cuales 205 corresponden a enzimas activas sobre carbohidratos (CAZimas). De las CAZimas predichas, 91 son glicosil hidrolasas (GH), de las cuales 32 poseen secuencia codificante para péptido señal, lo que indica que podrían ser extra-celulares. Para identificar las proteínas responsables de la actividad enzimática previamente observada, se analizó por espectrometría de masas el secretoma completo (conjunto de proteínas extracelulares) en sobrenadantes de cultivo en celulosa (carboximetilcelulosa, CMC), residuo agrícola de caña de azúcar molido (RAC) o paja de trigo pretratada por extrusión (PTE), como únicas fuente de carbono. En el sobrenadante de cultivo en CMC se identificaron 2 exoglucanasas (GH6 and GH48) y tres xilanasas GH10, mientras que el crecimiento en biomasa (RAC o PTE) resultó en la identificación de 22 CAZimas, incluyendo endo- y exoglucanasas (2 GH6, 2 GH9 y 1 GH48), xilanasas (7 GH10 y 1 GH11), una xiloglucanasa (GH74), una arabinofuranosidasa/ β-xilosidasa (GH43), una β-glucosidasa (GH3) y una αglucuronidasa (GH62), entre otras. Adicionalmente, se identificó una oxígenasa lítica de polisacáridos (LPMO) AA10, potencialmente involucrada en la deconstrucción de celulosa cristalina por un mecanismo oxidativo. La diversidad de GH10 secretadas (todas las extracelulares codificadas en el genoma) remarca la importancia de estas enzimas en la deconstrucción de biomasa. Para comenzar a evaluar la contribución individual de las xilanasas de la familia GH10 a la actividad del extracto, una GH10 con un módulo de unión a sustrato CBM2, a la que denominamos GH10XynC, fue expresada de manera recombinante en Escherichia coli y purificada en forma soluble. La enzima recombinante presentó actividad endoxilanasa (EC 3.2.8.1) en el rango de 300 UI/mg, sobre xilano de abedul y sobre arabinoxilano. No presentó actividad sobre celulosa, confirmando que es una xilanasa libre de actividad celulolítica. Los productos de hidrólisis de xilano fueron xilobiosa (X2) y xilosa (X1) en menor proporción y la actividad fue óptima a 50ºC, en un rango de pH de 5 a 7,5. Ensayos de hidrólisis con GH10XynC de paja de cebada y de trigo y el marlo de maíz dulce (MMD) (pre-tratados por extrusión) resultaron en la conversión a xilooligosacáridos, X2 y X1, demostrando la habilidad de la enzima de actuar sobre el xilano contenido en la biomasa. En conjunto, estos resultados demuestran que Cellulomonas sp. B6 constituye una fuente de enzimas con potencial aplicación agro-industrial en el aprovechamiento de biomasa lignocelulósica. Es más, la enzima GH10XynC podría ser aplicada en la utilización de xilanos para las indutrias de biocombustibles, prebióticos y alimento animal.

Lignocellulose is the major component of plant biomass. It consists of cellulose embedded in a matrix of hemicellulose and lignin. Aerobic cellulolytic microorganisms secrete a set of enzymes that allow them to degrade structural polysaccharides (cellulose and hemicelluloses) to use them as a carbon source. These enzymes are widely studied and have great importance, particularly for their potential application in the use of non-food biomass, such as agro-industrial waste, mainly to obtain biofuels or animal feed. The bacterial isolate Cellulomonas sp. B6 was obtained from a forest soil cellulolytic consortium. Cellulomonas sp. B6 was able to grow on numerous cellulosic substrates, including biomass. The culture supernatants showed mainly endo and exo-glucanase and xylanase activities and β-glucosidase and β-xylosidase activities were detected in the intracellular extracts. Growth in lignocellulosic biomass (sugar cane harvest residue, RAC) resulted in the highest enzymatic activity in the supernatant (0.2 and 0.6 IU/ml for the endoglucanase and xylanase activities, respectively). These activities were maintained in a pH range of 5 to 8 and a temperature of 40 to 55°C, indicating the potential of the extract for applications of biomass degradation under these conditions. By zymography, these activities correlated with proteins present in the culture supernatant. The genome of Cellulomonas sp. B6 was sequenced by Illumina MiSeq and assembled into 279 contigs, resulting in an 83X coverage. The total genome size was estimated at 4 Mb and the GC content was 75.1%, similar to that reported for reference strains of the genus. By phylogenetic analysis from the sequence of the 16S subunit of ribosomal RNA, it is related to Cellulomonas flavigena and Cellulomonas persica species, although Cellulomonas sp. B6 presents distinctive genotypic and metabolic characteristics, suggesting that it could be a new species. Annotation of the genome from Cellulomonas sp. B6 by the NCBI and RAST platforms, followed by analysis using the dbCAN platform, resulted in the identification of 3443 protein coding sequences, of which 205 corresponded to carbohydrates active enzymes (CAZymes). Of the predicted CAZymes, 91 were glycosyl hydrolases (GH), of which 32 possessed, signal peptide coding sequence, which indicated that they could be extracellular. To identify the proteins responsible for the enzymatic activity previously observed, the complete secretome (set of extracellular proteins) was analyzed by mass spectrometry in supernatants from cultures in cellulose (carboxymethylcellulose, CMC), in agricultural residue of ground sugar cane (RAC) or wheat straw pretreated by extrusion (PTE), as the sole carbon sources. In the CMC-culture supernatant, 2 exoglucanases (GH6 and GH48) and three GH10 xylanases were identified, whereas growth in biomass (RAC or PTE) resulted in the identification of 22 CAZymes, including endo- and exo-glucanases (2 GH6, 2 GH9 and 1 GH48), xylanases (7 GH10 and 1 GH11), a xyloglucanase (GH74), an arabinofuranosidase / β-xylosidase (GH43), a β-glucosidase (GH3) and an α-glucuronidase (GH62), among others. Additionally, a lytic polysaccharide monooxygenase (LPMO) AA10, potentially involved in cellulose deconstruction by an oxidative mechanism, was identified. The diversity of secreted GH10 (all of the extracellular ones encoded in the genome) highlights the importance of these enzymes in the deconstruction of biomass. To evaluate the individual contribution of the xylanases from the GH10 family to the activity of the extract, a GH10 xylanase with a CBM2substrate binding module, which we called GH10XynC, was expressed as recombinant in Escherichia coli and purified in soluble form. The recombinant enzyme showed endoxylanase activity (EC 3.2.8.1) in the range of 300 IU/mg, on birch xylan and on arabinoxylan. It did not present activity on cellulose, confirming that it is a xylanase free of cellulolytic activity. The hydrolysis products of xylan were xylobiose (X2) and xylose (X1) in lower proportion and the activity was optimal at 50°C, in a pH range of 5 to 7.5. Hydrolysis assays with GH10XynC of barley and wheat straw (BS, WS) and sweet corn cob (SCC) (pre-treated by extrusion) resulted in the conversion to xylooligosaccharides, X2 and X1, demonstrating the enzyme's ability to act on xylan content in biomass. Taken together, these results show that Cellulomonas sp. B6 is a source of enzymes with potential agro-industrial application in the use of lignocellulosic biomass. Moreover, GH10XynC could have applications in the bioconversion of xylans for biofuels, prebiotics and feed industries.