Microbiota nativa del tracto reproductor bovino: caracterización de cepas de Escherichia coli patogénicas y sensibilidad frente a extractos vegetales naturales

Abstract

La eficiencia en producción bovina de carne y leche depende de la performance reproductiva de los vientres, siendo afectada por infecciones del tracto reproductor. Aunque Escherichia coli forma parte de la microbiota nativa vaginal bovina, se reconoce a este microorganismo como partícipe necesario de dichas infecciones. Sin embargo, al inicio de este trabajo, no se habían descripto cuales modificaciones de esta microbiota predisponen a dichas infecciones, como tampoco, cuales características de E. coli determinan su capacidad patogénica en este tracto.En el presente trabajo mediante técnicas dependientes e independientes de cultivo, se puso en evidencia que la conformación de la microbiota vaginal depende del perfil reproductivo y del manejo animal. Patrones poblacionales particulares, obtenidos por PCR-DGGE y metagénica, se asociaron a: vaquillonas de carne sincronizadas (para inseminación artificial a tiempo fijo); vaquillonas y vacas de tambo, presentando estas últimas trastornos reproductivos (VTR) (enfermedad uterina posparto, EUP y síndrome de vaca repetidora de celo, SVRC). Los phylum bacterianos Fusobacteria y Bacteroidetes presentaron significativamente mayor abundancia relativa en el grupo EUP mientras que Proteobacteria lo fue en SVRC. En vaquillonas de carne sincronizadas se observó aumento significativo de la abundancia relativa de Tenericutes y Fusobacteria en el día de ovulación. Se describe por primera vez, la conformación filogenética, resistencia antimicrobiana y presencia de genes asociados a virulencia (FV) en poblaciones de E. coli vaginales nativas de animales de tambo: vaquillonas vírgenes, vacas con EUP y SVRC. Se identificaron 97 aislados de E. coli y se evaluó la variabilidad genética y conformación filogenética asociándolas con el grupo animal de origen; destacándose la asociación significativa entre SVRC y el filogrupo B1. Se detectó elevada prevalencia de resistencia, particularmente en aislados de VTR. La presencia de genes asociados a FV intestinales fue muy baja, probablemente, por una especificidad en el nicho. Sin embargo, la expresión y presencia de genes de FV relacionados a E. coli extra-intestinales mostró asociación con los perfiles reproductivos y se concluye que la EUP se asocia significativamente con mayor movilidad y presencia de fyuA, mientras que VTR se relaciona de manera significativa con formación de Biofilm y el gen csgA. La sensibilidad de E. coli con mayor potencial patogénico fue evaluada frente a extractos hidro-alcohólicos de origen vegetal. Así, los extractos de Aloe Barberensis miller, Salvia officinalis, Genciana Lutea, Malva Sylvestris y Matricaria chamomilla L evidenciaron la mejor actividad bacteriostática, mientras que la mayor acción bactericida se observó con Matricaria chamomilla L y Ruscus Aesculeatus sobre E. coli asociados a SVRC. Se demostró in vitro el sinergismo de extractos vegetales y antimicrobianos sobre E. coli resistentes, asociadas a VTR. Extractos de Salvia officinalis y Genciana Lutea aumentaron la sensibilidad a ciprofloxacina y amoxicilina, mientras que Matricaria chamomilla L y Aloysia triphylla lo hicieron para estreptomicina.Estos resultados sientan bases para el diseño de estrategias destinadas a monitorear y controlar la colonización de E. coli con potencial patogénico que representan riesgo para la sanidad del tracto reproductor bovino y por lo tanto, la fertilidad. Un recurso biotecnológico de esta naturaleza accionaría positivamente en la salud reproductiva de vacas y vaquillonas.

In both beef and dairy industries, productive efficiency depends on the reproductive performance and can be affected by reproductive tract infections. Even though Escherichia coli is part of the native vaginal microbiota, this microorganism is recognized as a necessary participant of the infections previously mentioned. However, until the beginning of this work, it has not been described which modifications of this microbiota may predispose to these infections nor there was consensus on the characteristics related to the pathogenic capacity of E. coli in this tract. In the present work, both dependent and independent culture techniques were used and the results showed that the conformation of the vaginal microbiota depended on the reproductive profile and management of the animals. Specific population patterns, obtained by PCR-DGGE and metagenic analysis, were associated to: synchronized beef heifers (for fixed time artificial insemination); heifers and dairy cows, these last presenting reproductive disorders (CRD) (postpartum uterine disease, PUD and repeater breeder syndrome, RBS). Fusobacteria and Bacteroidetes phyla showed significantly greater relative abundance in the PUD group and Proteobacteria, in the RBS group. In beef synchronized heifers a significant increase in the relative abundance of Tenericutes and Fusobacteria was observed on the ovulation day. This thesis describes, for the first time, the phylogenetic conformation, antimicrobial resistance and presence of genes associated with virulence (VF) in native E. coli populations of dairy animals: virgin heifers and cows with PUD and RBS. 97 E. coli were isolated and identified followed by the evaluation of their genetic variability and phylogenetic conformation by associating them with the animal group they were from of origin; highlighting the significant association between RBS and phylogenetic group B1. A high prevalence of resistance was detected, particularly in CRD isolates. The presence of genes associated with intestinal VF was very low, probably due to specificity in the niche. However, the expression and presence of VF genes related to extra-intestinal E. coli showed association with the reproductive profiles: PUD was significantly associated with bacterial motility and fyuA, while CRD was significantly related to Biofilm formation and the csgA gene. The sensitivity of E. coli with greater pathogenic potential was evaluated against hydro-alcoholic plant extracts. Thus, the extracts of Aloe Barberensis miller, Salvia officinalis, Gentiana Lutea, Malva Sylvestris and Matricaria chamomilla L showed the best bacteriostatic activity, while the highest bactericidal action was observed by Matricaria chamomilla L and Ruscus Aesculeatus on E. coli associated with RBS. The synergism of plant extracts and antimicrobials on resistant E. coli associated with CRD was demonstrated in vitro. Extracts of Salvia officinalis and Gentiana Lutea increased the sensitivity to ciprofloxacin and amoxicillin, while Matricaria chamomilla L and Aloysia triphylla had similar effect when combined with streptomycin. These results provide the basis for the design of strategies for monitoring and control the colonization of E. coli with pathogenic potential, that represent a risk for the health of the bovine reproductive tract and, therefore, fertility. A biotechnological resource of this nature would influence the reproductive health of cows and heifers.