Búsqueda de alternativas biotecnológicas para el manejo y\ o prevención de enfermedades de los citricos, cuarentenarias y/o emergentes.

Abstract

Argentina es el octavo productor mundial de cítricos y primer productor de limón (Citrus limon), por lo que la industria citrícola es una de las más importantes para la economía del país. La producción y comercialización se ve fuertemente afectada por las enfermedades cuarentenarias y/o emergentes. Entre ellas la cancrosis asiática de los cítricos, producida por la bacteria Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc), y el Huanglongbing, producida por especies del género Candidatus Liberibacter spp., son dos de las enfermedades de mayor incidencia en la citricultura de nuestro país y del mundo. El objetivo principal de este trabajo de tesis fue estudiar, desarrollar y optimizar estrategias biotecnológicas que permitan el manejo sustentable, la prevención o la detección temprana de enfermedades fitosanitarias de gran importancia en la citricultura argentina. Se realizó la caracterización de la interacción entre Citrus limon y el aislado AT de Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc AT) el cual presenta una virulencia disminuida (?avirulencia?) en limonero. Mediante estudios de transcriptoma se identificaron genes putativos de la planta que estarían involucrados en una respuesta de defensa inducida por Xcc AT, algunos de los cuales podrían ser utilizados para el mejoramiento genético contra la enfermedad. Considerando que Citrus limon es una especie recalcitrante para la regeneración in vitro de brotes, se optimizó un protocolo a partir de tejido juvenil de la variedad Eureka de C. limon, con el cual se aumentó la eficiencia de regeneración de 23 al 66 %. El porcentaje alcanzado permitirá iniciar experimentos de transformación genética de esta especie. Además, se realizó la transformación estable de Citrus sinensis cv. Pineapple con Agrobacetrium tumefaciens usando tejido juvenil. Se utilizó una construcción que contiene el gen de resistencia a X. vesicatoria Bs2 (de Capsicum annun), bajo el control del promotor del gen gst1 (de Solanun tuberosum) inducible por Xcc. Se obtuvieron 9 líneas transgénicas las cuales fueron desafiadas con la bacteria virulenta Xcc para evaluar la funcionalidad del transgen. En 2 de las 11 líneas portadoras del gen Bs2 se observó una disminución del área afectada con síntomas de la enfermedad. Estos resultados fueron validados a través de PCR en tiempo real evaluando los niveles de expresión del gen Bs2. Por la técnica "Southern blot" se observó que las líneas transgénicas resistentes presentan dos copias del gen Bs2 y que ambos son eventos diferentes. Paralelamente se realizó una búsqueda "in silico" de promotores inducibles y de genes candidatos que puedan ser potencialmente útiles para el control de enfermedades en cítricos. Por útimo se optimizaron metodologías de diagnóstico molecular para la detección de la bacteria Candidatus Liberibacter spp. a través de PCR convencional y en tiempo real. También se diseñó un juego de cebadores que amplifica un fragmento del gen 16S ADNr de las tres especies asociadas a HLB en una misma reacción. Estos resultados se desarrollaron en el marco del Programa Nacional de Prevención de HLB de Argentina.

Argentina ranks eighth and first in citrus and lemon (Citrus limon) production, respectively, in the world. This makes citrus manufacturing one of the most important economic activities in the country. However, both citrus production and marketing are negatively affected by quarantinable and emerging diseases. Among these, the Asian citrus canker, caused by Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc), and Huanglongbing, triggered by Candidatus Liberibacter spp., are two of the diseases with most incidence in citrus crops in our country and worldwide. This thesis aimed principally to study, develop, and optimize biotechnological methods for a sustainable management, prevention, or early detection of plant diseases of high impact on citrus production in Argentina. The interaction between Citrus limon and the AT isolate of Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc AT), which presents a lower virulence (‘avirulence’) in lemon, was characterized. Via transcriptome studies, putative genes that might be involved in a Xcc AT-induced response were identified. Some of these could be used in resistance breeding against the disease. Considering that Citrus limon is recalcitrant for in vitro shoot regeneration, a protocol using young tissue from Eureka (C. limon) variety was optimized, increasing regeneration efficiency from 23 to 66 %. This achievement will signal the beginning of genetic modification trials for this species. Moreover, stable genetic transformation of Citrus sinensis cv. Pineapple with Agrobacetrium tumefaciens was accomplished by using young tissue. A construction with the X. vesicatoria Bs2 resistance gene (of Capsicum annun), under the control of gst1 gene promoter (of Solanun tuberosum) inducible by Xcc, was used. Seven transgenic lines were obtained and challenged by virulent Xcc bacterium to evaluate the functionality of the transgene. It was observed that 2 of the 7 lines with Bs2 gene showed a decrease in the area presenting symptoms of the disease. These results were validated by means of a real time PCR, while evaluating Bs2 gene expression levels. The Southern blot technique further allowed identifying two Bs2 gene copies in the resistant transgenic lines, both of which constituted different events. In the meantime, inducible promoters and candidate genes that could potentially be used to control citrus diseases were in silico searched. Finally, molecular diagnosis methodologies for detecting Candidatus Liberibacter spp. bacterium with conventional and real time PCR were optimized. In addition, it was possible to design a set of primers which amplify a 16S rDNA gene fragment of the three HLB related species with a single reaction. All these developments were attained as part of the activities of Argentina’s National HLB Prevention Program