Selección de aislamientos nativos de Metarhizium anisopliae como potenciales agentes de control biológico de Aedes aegypti (Diptera, Culicidae)

Abstract

En este trabajo de tesis doctoral, se evaluó la efectividad del hongo entomopatógeno Metarhizium anisopliae como agente de control biológico del mosquito Aedes aegypti, vector de diversos arbovirus. Para ello se utilizaron diferentes metodologías de aplicación de conidios y se evaluaron diferentes parámetros que reflejan la patogenicidad, virulencia y agresividad de diferentes aislamientos fúngicos.En primer lugar, se realizaron bioensayos para seleccionar cepas fúngicas nativas, preservadas en la Colección de Hongos Entomopatógenos del CEPAVE (La Plata, Buenos Aires, Argentina) (CEP 085, CEP 087, CEP 120, CEP 350, CEP 404 y CEP 423), eficaces contra adultos de Ae. aegypti. El ensayo fue realizado por aspersión directa de los conidios en suspensión sobre los insectos. Se aplicó un inóculo de cada cepa a diferentes concentraciones (5 x 106, 107, 5 x 107 y 108 conidios/ml). Durante 10 días se registró la mortalidad de los insectos y se separaron los adultos muertos para verificar la infección fúngica. Se utilizaron curvas de Kaplan-Meier para graficar la probabilidad de supervivencia de Ae. aegypti en función del tiempo para cada cepa fúngica y para cada concentración. Las diferencias entre las curvas se analizaron mediante un análisis Log-Rank y comparaciones post-hoc entre pares. Además, se determinó para cada una de las cepas fúngicas la viabilidad, la mortalidad sobre adultos de Ae. aegypti, el tiempo letal medio (TL50 y TL90) y la concentración letal media (CL50). La existencia o no de diferencias significativas entre las cepas para cada una de estas variables se determinó mediante análisis de ANOVA y comparaciones post-hoc (Tukey) en el caso de la viabilidad; mediante análisis de proporciones con aproximación Chi cuadrado y comparaciones post-hoc entre pares en el caso de la determinación de las diferencias en el porcentaje de insectos infectados y, por último, para determinar la existencia de diferencias en el TL50, TL90 y CL50 se utilizó el análisis de la superposición de los intervalos de confianza de 95%. El tiempo de supervivencia de los insectos tratados fue menor que el de los controles para todas las cepas. Se encontró un efecto significativo de la concentración del inóculo en las curvas de supervivencia de Kaplan-Meier y en el porcentaje de individuos muertos con confirmación de la infección fúngica, para las seis cepas analizadas. Con una concentración de 5 x 107 conidios/ml, el tiempo de supervivencia de los mosquitos varió entre 4,5 (CEP 404) y 7 (CEP 087) días posteriores a la aplicación del inóculo, contra una mediana de 10 días correspondiente a los controles. El porcentaje de individuos infectados fue entre 50 (CEP 404) y 87% (CEP 423). El TL50 varió entre 6 y 7 días para todas las cepas fúngicas y no hubo diferencias significativas entre las cepas, como así tampoco en el TL90. La viabilidad fluctuó entre 82 (CEP 423) y 97% (CEP 085) con diferencias significativas entre las cepas. También se encontraron diferencias significativas en la CL50 entre las cepas. Según este último parámetro, la cepa fúngica más virulenta fue CEP 423, con una CL50 de 2,4 x 106 conidios/ml.A continuación, se procedió a inocular tres tipos de telas, de diferente coloración y composición, con el aislamiento fúngico CEP 423. Estas telas fueron luego utilizadas como sitio de reposo de los mosquitos de modo que allí fueran infectados con los conidios. Se utilizó una tela blanca de 60% algodón-40% poliéster, una roja de 100% poliéster y una negra de 100% poliéster de trama más amplia. Se evaluó el efecto del tiempo de exposición de los mosquitos a cada sustrato (6 o 24 h) y del tipo de sustrato, en las curvas de supervivencia de Kaplan-Meier de Ae. aegypti y en la proporción de insectos infectados. También se cuantificó la persistencia en el tiempo (1, 2 o 15 días) de los conidios viables sobre cada tela. La tela blanca provocó una disminución significativa en la supervivencia respecto a los controles. El menor valor de supervivencia fue de 6,5 días con 24 h de exposición. No se encontró un efecto significativo del tiempo de exposición en las curvas de supervivencia de Kaplan-Meier. El porcentaje de infección máximo obtenido fue de 50% con exposición de 6 h. La viabilidad de los conidios allí aplicados disminuyó desde 88 (1 día) a 22% (15 días). La tela roja provocó diferencias significativas en el tiempo de supervivencia respecto al control solo con 24 h de exposición. El tiempo de supervivencia menor fue de 9 días con 24 h de exposición. Se encontró un efecto del tiempo de exposición, aumentando significativamente el porcentaje de infección (máximo alcanzado 45%) al aumentar el tiempo de exposición. La tela de color rojo fue el sustrato en el cual la viabilidad de los conidios inoculados disminuyó menos a lo largo del tiempo (47% a los 15 días post-aplicación). La tela negra provocó diferencias en el tiempo de supervivencia respecto al control solo con 6 h de exposición. El tiempo de supervivencia menor fue de 9 días con 6 h de exposición, sin embargo, tanto el porcentaje de infección fúngica (15%) como la viabilidad (37%) de los conidios fueron bajos. En general, la persistencia de los conidios viables adheridos a estos sustratos fue dependiente del tipo de sustrato y del tiempo post-aplicación.También, fueron evaluadas la viabilidad y virulencia de M. anisopliae IP 46 (aislamiento fúngico nativo de Brasil) sometido a diferentes dosis de radiación UV-B (0-16,6 kJ m-2). Por un lado, los tratamientos consistieron en la exposición a la radiación UV-B de: i. adultos de Ae. aegypti inoculados previamente con conidios, ii. conidios sobre un medio de cultivo y iii. conidios sobre un tejido inerte. Se encontró un efecto significativo de la dosis de radiación en la viabilidad que, sobre medio de cultivo, fue completamente inhibida con dosis de radiación ≥ 8,3 kJ m-2 y retrasada con dosis de 2,1 y de 4,1 kJ m-2. Sobre un tejido inerte la viabilidad de los conidios fue retrasada pero no completamente inhibida, incluso sin encontrarse un efecto significativo de la dosis de radiación luego de 72 h de incubación. El porcentaje de mortalidad de los adultos de Ae. aegypti tratados con IP46 varió entre 43,8 y 70% luego de 15 días de tratamiento, y no se encontró un efecto significativo de la dosis de radiación en la patogenicidad. Tampoco se encontraron diferencias significativas en la conidiogénesis sobre los cadáveres. Por otro lado, se sometieron conidios a cada dosis de UV-B, en recipientes que simulaban ser sitios de cría de Ae. aegypti, bajo una columna de agua de espesor variable (0-3 cm de altura). En cuanto a la viabilidad de los conidios, se encontró un efecto significativo tanto de la dosis de radiación como del nivel de agua. En relación a la patogenicidad de IP46 contra larvas de Ae aegypti, el porcentaje de mortalidad obtenido varió entre 60 y 90% luego de 10 días de tratamiento y no se encontró un efecto significativo de la columna de agua ni de la dosis de radiación.De acuerdo a los resultados obtenidos, se destaca el potencial de la cepa CEP 423 de M. anisopliae como agente de control biológico de Ae. aegypti, debido a su virulencia. Además, el sustrato que resultó con mejores características para la aplicación indirecta de conidios fue la tela blanca ya que los conidios permanecieron viables e infectivos, al ser aplicados sobre esta superficie. Este trabajo de tesis doctoral brinda, además, conocimientos de cómo la radiación UV-B afecta la viabilidad y la patogenicidad contra Ae. aegypti de la cepa IP 46 de M. anisopliae, información de mucha utilidad a la hora de planificar la aplicación de esta cepa en futuros trabajos de campo.

In this doctoral thesis, the effectiveness of the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae as a biological control agent of the mosquito Aedes aegypti, a vector of several arboviruses, was evaluated. To this end, several methodologies for conidial application were assessed and different parameters were evaluated in order to determine pathogenicity, virulence and aggressiveness of different fungal isolates. In the first place, bioassays were carried out to select native fungal strains, preserved in the Collection of Entomopathogenic Fungi of the CEPAVE (La Plata, Buenos Aires, Argentina) (CEP 085, CEP 087, CEP 120, CEP 350, CEP 404 and CEP 423), effective against adults of Ae. aegypti. Assays were performed by directly spraying a conidial suspension towards the insects. An inoculum of each strain of different concentrations (5 x 106 , 107 , 5 x 107 and 108 conidia/ml) was applied. For 10 days the mortality of the insects was registered and the dead ones were separated to verify the fungal infection. Kaplan-Meier curves were used to illustrate the survival probability of Ae. aegypti over time, for each fungal strain and for each concentration. Differences among curves were analysed by means of Log-Rank test and post-hoc pairwise comparisons. Besides, the viability, the mortality of the adults of Ae. aegypti, the mean lethal time (LT50 and LT90) and the mean lethal concentration (LC50) were determined for each fungal strain. The existence or not of significant differences among the strains for each of these variables was determined by means of an ANOVA and post-hoc comparisons (Tukey) in the case of viability; a test of proportions with Chi-square approximation and post-hoc pairwise comparisons for the percentage of insects infected with the fungus; and finally, significant differences in LT50, LT90 and LC50 were analysed by checking for superposition between 95% confidence intervals. The survival time of the treated insects was lower than that of the controls, for all the strains. The inoculum concentration had a significant effect in the Kaplan-Meier survival curves and also in the percentage of dead individuals with confirmation of fungal infection, for the six strains analysed. At a concentration of 5 x 107 conidia/ml, the mosquitoes survival time ranged from 4.5 (CEP 404) to 7 (CEP 087) days after the begging of the assays, against a median of 10 days corresponding to all the controls. The percentage of infected individuals was from 50 (CEP 404) to 87% (CEP 423). There were no significant differences in LT50, which varied from 6 to 7 days, nor in LT90. Viability fluctuated from 82 (CEP 423) to 97% (CEP 085) with significant differences among strains. Significant differences were also found among the LC50. According to this last parameter, the most virulent fungal strain was CEP 423, with a LC50 of 2.4 x 106 conidia/ml. Afterwards, 3 types of fabrics, of different colour and composition, were inoculated with the fungal strain CEP 423. Fabrics were then used by mosquitoes as resting places and therefore they could become infected with conidia. A white cloth of 60% cotton-40% polyester, a red one of 100% polyester and a black one of 100% polyester, with a wider weft, were used. The effects of the exposure time to each substrate (6 or 24 hours) and of the type of substrate itself were evaluated in the Kaplan-Meier survival curves of Ae. aegypti and in the proportion of the infected insects. The persistence over time (1, 2 or 15 days) of the viable conidia on each fabric was also quantified. The white cloth caused a significant decrease in survival with respect to the controls. The lowest survival value was 6.5 days with 24 hours of exposure. No significant effect of exposure time was found in the Kaplan-Meier survival curves. The percentage of maximum infection achieved was 50% with 6 hours of exposure. The viability of the conidia applied to this substrate, decreased from 88 (1 day) to 22% (15 days). The red cloth caused significant differences in the survival time compared to the controls, only with 24 hours of exposure. The shortest survival time was 9 days with 24 hours of exposure. An effect of the exposure time was found, significantly increasing the percentage of infection (maximum reached 45%) by increasing the exposure time. The red cloth was the substrate in which the viability of the inoculated conidia decreased less over time (47% at 15 days post-application). The black cloth caused differences in the survival time compared to the control only with 6 hours of exposure. The shortest survival time was 9 days with 6 hours of exposure, however, the percentage of fungal infection achieved (15%) and the viability of the conidia (37.3%), were very low values. In general, the persistence of the viable conidia adhered to these substrates was dependent on the type of fabric and the post-application time. Besides, the viability and virulence of M. anisopliae IP 46 subjected to different doses of UV-B radiation (0-16.6 kJ m-2) were evaluated. On the one hand, adults which were previously treated with conidia were exposed to radiation. Also were exposed, conidia on a culture medium or conidia applied on an inert fabric. A significant effect of the radiation dose on viability was detected, which, on a culture medium, was completely inhibited with radiation doses ≥8.3 kJ m-2 and delayed with doses of 2.1 and 4.1 kJ m-2 . On an inert fabric, the viability of the conidia was delayed but not completely inhibited, without finding a significant effect of the radiation dose after 72 hours of incubation. No significant effect of the dose of UV-B was found in the pathogenicity nor in the conidiogenesis over the corpses. On the other hand, conidia in containers that simulated breeding sites of Ae. aegypti, under a water column of varying thickness (0-3 cm in height), were subjected to each dose of UV-B. As regards viability of conidia, significant effects of the UV-B dose and of the water column were detected. Virulence of conidia towards the larvae of Ae. aegypti was not affected by the UV-B dose nor by the water column. According to the obtained results, the strain CEP 423 of M. anisopliae, is highlighted as a potential biological control agent of Ae. aegypti. On the other hand, the white cloth was the substrate that showed the best characteristics for the indirect application of conidia. This doctoral thesis work also contributes to the knowledge of how UV-B light affects the viability and pathogenicity against Ae. aegypti of the M. anisopliae strain IP 46, which determines the possibility of a future application in the field.