Estudio de las características bio-ecológicas de un aislamiento autóctono del entomonemátodo Heterorhabditis bacteriophora (Nematoda: Heterorhabditidae) y su potencialidad como agente bioregulador de insectos

Abstract

Algunos nematodos parásitos de insectos tienen relaciones simbióticas con bacterias que son responsables de matar rápidamente a los insectos parasitados. A causa de esta muerte rápida, el termino entomopatógenos es utilizado para describir a estos nematodos. Los nematodos entomopatógenos de las familias Heterorhabditidae forman una simbiosis mutualista con bacterias patógenas de insectos de la familia Enterobacteriaceae, específicamente del genero Photorhabdus. Los juveniles infectivos (JIs) permanecen en el suelo en busca de un insecto hospedador adecuado. Tras la entrada a través de la cutícula o las aberturas naturales del hospedador, los JIs liberan las bacterias simbióticas en el hemocele de los insectos, provocando la muerte del mismo dentro de las 24-48 hs. Los nematodos se alimentan de las bacterias simbióticas, completan 1-3 generaciones en el cadáver del hospedador y, a medida que se agotan los recursos alimenticios, se producen nuevos JIs que se dispersan en busca de nuevos hospedadores. La variabilidad del complejo nematodo-bacteria, condiciona su virulencia, la cual a su vez se relaciona con el área de procedencia. Las especies nativas son consideradas en programas de control biológico de plagas respecto a especies introducidas, ya que se espera estén adaptadas a las condiciones locales, incluyendo a la propia plaga. El relevamiento de muestras de suelo provenientes de una huerta orgánica del cinturón hortícola platense, reveló la presencia de un nuevo aislado de Heterorhabditis bacteriophora, estudios morfológicos y moleculares, mostraron que las características morfológicas fueron cualitativamente similares a la de otras poblaciones de Heterorhabditis citadas y los análisis bioinformáticos permitieron determinar que este nematodo fuera un nuevo aislamiento de H. bacteriophora, el cual fue designado como Heterorhabditis bacteriophora SUP. Esta población representa un nuevo registro para el cinturón hortícola platense. A su vez, mediante estudios de morfología de las colonias, pruebas bioquímicas, biotipificación y análisis moleculares se caracterizó la bacteria endosimbionte asociada a este aislamiento como Photorhabdus luminescens. El uso excesivo de agroquímicos y la carencia de productos para control de plagas constituye uno de los principales problemas en el cinturón hortícola bonaerense por lo cual los enemigos naturales (parásitos, patógenos y depredadores) constituyen una alternativa de control de plagas de importancia agroeconómica. La caracterización de los diferentes aislados es necesaria para la búsqueda de nuevas alternativas al uso de agroquímicos para el control de plagas en la región. El uso y éxito de estos organismos a campo como agentes de biocontrol exige una metodología eficiente de producción que proporcione altas densidades de JIs sin alterar su virulencia. Cuando se aísla un agente de control biológico a partir de un ambiente natural y es criado en el laboratorio, o producido en masa con fines comerciales, sus atributos biológicos pueden alterarse dando lugar a la disminución y pérdida de la patogenia y la longevidad durante los procesos de producción, desarrollo y formulación, afectando laviabilidad de los productos comerciales. Varios factores podrían afectar su eficacia, entre ellos, la selección del hospedador para la cría in vivo. Tenebrio molitor se mostró susceptible a H. bacteriophora SUP cuya infectividad resultó ser mayor conforme al aumento de concentración de JIs, obteniéndose menores tiempos letales, sin embargo, la mayor producción de JIs se obtuvo con las menores concentraciones de exposición evaluadas. Dada la susceptibilidad de las larvas de T. molitor a la cepa en estudio, el uso de estos insectos como insectos de cría para la producción in vivo de H. bacteriophora representa una alternativa viable respecto al uso de Galleria melonella, debido a la facilidad para criarlos en el laboratorio y a los bajos costos económicos asociados. En este sentido, para maximizar la producción de este aislamiento deberían utilizarse las concentraciones más bajas. La viabilidad es otro factor a considerar, durante sus condiciones de almacenamiento, la temperatura y la densidad afectaron la supervivencia media de los JIs almacenados, resultando esta menor conforme aumenta la temperatura y a su vez por incremento de la densidad; resultando más adecuadas para su almacenamiento las temperaturas de 4 y 16°C y bajas concentraciones de JIs. A pesar de garantizar una amplia supervivencia, la temperatura de 4°C redujo significativamente la virulencia de los nematodos almacenados sin pasar por un hospedador. En cuanto a la eficacia de los JIs, la infectividad de la cepa en estudio fue mayor a superficies intermedias de exposición, obteniéndose mayores porcentajes de mortalidad con una concentración de 1000 JIs en capsulas de 10 cm respecto a 5 y 25 cm. En concordancia con la zona de origen de este aislamiento, caracterizada por un clima templado a cálido con un promedio anual de temperatura de 17°C, la viabilidad de la cepa, reproducción, actividad, infectividad y supervivencia resultaron óptimas en un rango de temperatura de 16 a 25°C, siendo 16°C la temperatura más adecuada para su mantenimiento en el laboratorio en pos de asegurar una alta longevidad, supervivencia y virulencia sostenida en el tiempo. La infectividad de los JIs podría estar relacionada con la viabilidad de su bacteria endosimbionte, en este sentido, las pruebas de viabilidad en medio líquido para P. luminescens, permitieron establecer un rango de temperatura de 16 a 25°C en el cual las bacterias sobrevivieron por más de 20 semanas. La utilización de enemigos naturales constituye uno de los pilares del manejo integrado de plagas, cuyo objetivo es reducir por debajo del nivel de daño económico la población de una plaga por medio de la utilización de diferentes estrategias de control, entre las que se encuentran el control biológico. En la Provincia de Buenos Aires la horticultura es una de las actividades agrícolas más importantes. Los reportes de plagas emergentes en huertas de producción orgánica, como el coleóptero Lobiopa insularis en cultivos de frutilla y Phyrdenus muriceus en cultivos de berenjena hace necesaria la búsqueda y evaluación de enemigos naturales para su uso en control biológico. La susceptibilidad de estos coleópteros al aislamiento caracterizado en este estudio fue probada. El aislamiento nativo H. bacteriophora SUP resultó ser infectivo sobre L. insularis, registrándose una susceptibilidad decreciente de 77,10; 56,67 y 25,00%, para larvas, pupas y adultos, respectivamente. La mayor susceptibilidad de larvas y pupas, sumado al comportamiento de estos insectos de dirigirse al suelo para empupar, los convierte en un blanco adecuado para el control con nematodos entomopatógenos. H. bacteriophora SUP pudo completar el ciclo en todos los estados de desarrollo de L. insularis, lo cual mejoraría el establecimiento y la propagación de este aislamiento tras una aplicación en el campo. Dada la susceptibilidad registrada y la factibilidad de su empleo en el control de los estados del coleóptero, se realizó una evaluación a campo, la cual incluyó la liberación de los JIs en la estación experimental Julio Hirschhorn ubicada en Los Hornos, Provincia de Buenos Aires para evaluar el efecto de control sobre L. insularis en cultivos de frutilla. Previo a la liberación se realizó un monitoreo en el cual se registró el número de frutillas presentes en el cultivo, se contabilizaron y clasificaron las frutillas por estado de maduración (verde, roja y fermentada) y se contabilizó el número de coleópteros por fruta examinada. La aplicación se realizó por medio de suspensiones acuosas de JIs. Se trataron un total de 6 parcelas, utilizando una concentración de 10.000 JIs por planta, y se marcaron otras 6 como controles. Los registros post-aplicación no arrojaron diferencias significativas entre parcelas tratadas y controles. Sin embargo, al comparar los registros pre-aplicación y post-aplicación, se detectaron diferencias significativas en el porcentaje de frutillas atacadas, 32% para los registros pre-aplicación y 28 y 17% para parcelas control y tratadas post-aplicación, respectivamente. Estas diferencias podrían ser atribuidas a una reducción del número de frutas disponibles como fuentes de alimento, y/o a la dispersión de los JIs desde las parcelas aplicadas hacia los controles. Los resultados indicaron que el 93,14% de los coleópteros se encontraron en las frutillas fermentadas, y que la proporción de frutillas fermentadas atacadas fue mayor a los otros estados. Por otro lado, la infectividad en trampas cebo colocadas en el campo demostró la persistencia de los nematodos durante el periodo evaluado (8 meses) y su dispersión a lo largo del cultivo. A los tres meses de ser aplicado se lo encontró en el 92% de las muestras de suelo colectadas, encontrándolos a lo largo de todos los camellones, incluidos los no tratados. H. bacteriophora SUP demostró varios atributos como potencial agente de control de L. insularis: se trata de una población adaptada a las condiciones ambientales y climáticas locales, provocó la muerte de los tres estados de la plaga, demostró un amplio poder de dispersión por medio de movimientos activos y/o pasivos, y a su vez pudo persistir en el ambiente. Las pruebas de laboratorio demostraron la susceptibilidad del coleóptero Phyrdenus muriceus a H. bacteriophora SUP, demostrando mayor virulencia frente a larvas y pupas, probablemente debido a la baja movilidad de estos estados respecto a los adultos. El nematodo pudo completar su ciclo en todos los estados evaluados. Dada la susceptibilidad de la plaga al aislamiento estudiado, la escasez de enemigos naturales y el nivel de daño ocasionado por los coleópteros en el momento de la plantación de los cultivos, pruebas de campo fueron realizadas con el objetivo de evaluar el control sobre P. muriceus. La liberación de H. bacteriophora SUP se realizó empleando dos metodologías de aplicación. El monitoreo de la plaga se estimó a partir del daño producido en las hojas, contabilizando el número de agujeros (daño) por hoja producidos por los gorgojos al alimentarse de la planta. Las evaluaciones realizadas luego de la primera aplicación, no mostraron un efecto positivo sobre la reducción de las poblaciones de P. muriceus. Los registros de daño en hojas no mostraron diferencias significativas entre tratamientos y controles, el rango de daño fue de 5,4- 6,1 agujeros/hoja; mientras que luego de una segunda aplicación de JIs, se detectaron diferencias significativas entre los tratamientos, cuyo rango de daño promedio fue de 26,4 -42 agujeros/hoja. Estas diferencias detectadas sumadas a la colecta de adultos de P. muriceus infectados con H. bacteriophora, permitieron determinar la eficacia de este nematodo sobre el control de esta plaga. A su vez, muestras de suelo fueron evaluadas mensualmente con el fin de conocer la persistencia y dispersión de los JIs aplicados en este cultivo. A partir de los datos obtenidos, se observó que dos meses después de la aplicación, los JIs se dispersaron a las parcelas asignadas como controles, ubicadas a 3 metros de los puntos de aplicación. Esto pudo deberse en parte al movimiento activo de los NEPs, y a su vez, a los movimientos pasivos, a través de hospedadores infectados, foresis y el agua. A partir de las muestras de suelo procesadas se pudo comprobar que durante siete meses el nematodo pudo persistir en el ambiente, lo cual podría deberse a la tolerancia de la larva dauer a la desecación y/o a la infección de nuevos hospedadores. Sin embargo, la dispersión fue menor a la registrada en el cultivo de frutilla. Esto podría deberse a una distribución insuficiente de la humedad a lo largo del cultivo dado el tipo de riego utilizado, el cual se realiza por surcos de inundación, cuya eficiencia puede ser tan baja que puede llegar a menos del 40% del cultivo. Los resultados obtenidos indicarían que H. bacteriophora SUP, podría ser un potencial agente de control de P. muriceus, dada la susceptibilidad demostrada en condiciones de laboratorio, la reducción del daño foliar registrado en el campo en los tratamientos realizados, y la recuperación de ejemplares infectados con el nematodo aplicado. Heterorhabditis bacteriophora SUP representa el primer registro de un nematodo entomopatógeno asociado a cultivos de tomate en el cinturón hortícola platense, sumándose a la lista de los enemigos naturales presentes en este cultivo, considerándose como un potencial agente de control de coleópteros plaga. Los resultados demostraron su potencialidad como biocontrolador de diferentes plagas agrícolas, debido a la factibilidad de producción en el laboratorio a la capacidad de infección, establecimiento y dispersión en condiciones naturales en dos agroecosistemas distintos.

Some insect parasitic nematodes have symbiotic relationships with bacteria that are responsible for rapidly killing parasitized insects. Because of this rapid death, the term entomopathogens is used to describe these nematodes. The entomopathogenic nematodes of the Heterorhabditidae family form a mutualistic symbiosis with insect pathogenic bacteria of the family Enterobacteriaceae, specifically of the genus Photorhabdus. Infective juveniles (IJs) remain in the soil in search of a suitable insect host. After entry through the cuticle or natural openings of the host, the IJs release the symbiotic bacteria in the hemocel of the insects, causing its death within 24-48 hours. The nematodes feed on the symbiotic bacteria, complete 1-3 generations in the corpse of the host and, as the food resources are depleted, new IJs are produced. These IJs disperse in search of new hosts. The variability of the nematode-bacteria complex determines its virulence, which in turn is related to the area of origin. The native species are considered in programs of biological control of pests with respect to introduced species, since they are expected to be adapted to local conditions, including the pest itself. The survey of soil samples from an organic orchard of the Cinturón Hortícola Platense (CHP), revealed the presence of a new isolate of Heterorhabditis bacteriophora. Morphological and molecular studies, showed that the morphological characteristics were qualitatively similar to that of other populations of Heterorhabditis cited and the bioinformatic analysis allowed to determine that this nematode was a new isolation of H. bacteriophora, which was designated as Heterorhabditis bacteriophora SUP. This population represents a new record for the Cinturón Hortícola Platense (CHP). At the same time, by means of studies of colony morphology, biochemical tests, biotyping and molecular analysis, the endosymbiotic bacterium associated with this isolation was characterized as Photorhabdus luminescens. The excessive use of agrochemicals and the lack of products for pest control are one of the main problems in the Cinturón Hortícola de Buenos Aires, which is why natural enemies (parasites, pathogens and predators) constitute an alternative to control pests of agroeconomic importance. The characterization of the different isolates is necessary for the search of new alternatives to the use of agrochemicals for the control of pests in the region. The use and success of these organisms in the field as biocontrol agents requires an efficient production methodology that provides high densities of IJs without altering their virulence. When a biological control agent is isolated from a natural environment and is reared in the laboratory or mass produced for commercial purposes, its biological attributes can be altered resulting in the decrease and loss of pathogenesis and longevity during the processes of production, development and formulation, affecting the commercial product’s viability. Several factors could affect its effectiveness, including the selection of the host for in vivo breeding. Tenebrio molitor was susceptible to H. bacteriophora SUP whose infectivity was higher according to the increase of IJs concentration, obtaining lower lethal times, however, the highest production of IJs was obtained with the lowest (saqué exposure)concentrations evaluated. Given the susceptibility of T. molitor larvae to the strain under study, the use of these insects as breeding insects for the in vivo production of H. bacteriophora represents a viable alternative to the use of Galleria melonella, due to the easy breeding in the laboratory and (saqué at) the associated low economic costs. Therefore, the lowest concentrations should be used to maximize the production of this isolate. Viability is another factor to be considered, during storage conditions, temperature and density affected the average survival of the stored IJs, being lower as the temperature increases and in turn increasing the density; the temperatures of 4 and 16 ° C and low concentrations of IJs are better suited for storage. Despite guaranteeing a broad survival, the temperature of 4 ° C significantly reduced the virulence of stored nematodes without going through a host. Regarding the efficacy of the IJs, the infectivity of the strain under study was higher than intermediate surfaces of exposure, obtaining higher mortality percentages with a concentration of 1000 IJs in 10 cm capsules compared to 5 and 25 cm. In agreement with this isolation origin zone, characterized by a temperate to warm climate with an annual average temperature of 17 ° C, the viability of the strain, reproduction, activity, infectivity and survival were optimal in a temperature range of 16 to 25 ° C, being 16 ° C the most adequate temperature for its maintenance in the laboratory in order to ensure a high longevity, survival and sustained virulence over time. The infectivity of the IJs could be related to the viability of their endosymbiotic bacteria. The viability tests in liquid medium for P. luminescens, allowed to establish a temperature range of 16 to 25 ° C in which the bacteria survived for more than 20 weeks. The use of natural enemies is one of the foundations of integrated pest management, whose objective is to reduce the population of a pest below the level of economic damage through the use of different control strategies, among which are the biological control. In Buenos Aires Province, horticulture is one of the most important agricultural activities. Reports of emerging pests in organic production gardens, such as the Coleoptera Lobiopa insularis in strawberry crops and Phyrdenus muriceus in eggplant crops, make necessary to search for and evaluate natural enemies for their use in biological control. The susceptibility of these coleoptera to the isolation characterized in this study was proven. The native isolation H. bacteriophora SUP was found to be infective on L. insularis, with a decreasing susceptibility of 77.10; 56.67 and 25.00%, for larvae, pupae and adults, respectively. The greater susceptibility of larvae and pupae, added to the behavior of these insects to go to the soil to pupate, make them an adequate target for control with entomopathogenic nematodes. H. bacteriophora SUP was able to complete its life cycle in all stages of development of L. insularis, which would improve the establishment and spread of this isolation after application in the field. Given the registered susceptibility and the feasibility of its use in the control of the coleoptera stages, an on-site evaluation was carried out, which included the release of the IJs in the Julio Hirschhorn experimental station located in Los Hornos, Buenos Aires Province to evaluate the control effect on L. insularis in strawberry crops. Prior to the release, a monitoring was carried out in which the number of strawberries present in the crop was recorded, the strawberries were counted and classified by ripening stage (green, red and fermented) and the number of coleoptera was counted per fruit examined. The application was made by means of aqueous suspensions of IJs. A total of 6 plots were treated, using a concentration of 10.000 IJs per plant, and another 6 were marked as controls. The postapplication records did not show significant differences between treated plots and controls. However, when comparing pre-application and post-application records, significant differences were detected in the percentage of strawberries attacked, 32% for pre-application records and 17 and 28% for post-application treated plots and control, respectively. These differences could be attributed to a reduction in the number of available fruits as source of food, and / or to the dispersion of the IJs from the plots applied to the controls. The results indicated that 93.14% of the Coleoptera were found in the fermented strawberries, and that the proportion of fermented strawberries attacked was higher than the other states. On the other hand, the infectivity in bait traps placed in the field showed the persistence of the nematodes during the evaluated period (8 months) and their dispersion throughout the crop. Three months after application, it was found in 92% of the collected soil samples, finding them along all the ridges, including the untreated ones. H. bacteriophora SUP demonstrated several attributes as a potential control agent of L. insularis: it is a population adapted to local environmental and climatic conditions, it caused the death of the three stages of the pest, it demonstrated a high dispersion capacity by means of active and / or passive movements, and in turn could persist in the environment. The laboratory tests demonstrated the susceptibility of the Coleoptera Phyrdenus muriceus to H. bacteriophora SUP, demonstrating greater virulence against larvae and pupae, probably due to the low mobility of these states with respect to adults. The nematode was able to complete its life cycle in all the evaluated stages. Given the susceptibility of the pest to the studied isolation, the scarcity of natural enemies and the level of damage caused by the coleoptera at the time of planting the crops, field tests were conducted with the objective of evaluating the control of P. muriceus. The release of H. bacteriophora SUP was done using two application methodologies. The monitoring of the pest was estimated from the damage produced in the leaves, counting the number of holes (damage) per leaf produced by the weevils when feeding on the plant. The evaluations carried out after the first application did not show a positive effect on the reduction of P. muriceus populations. Leaf damage records showed no significant differences between treatments and controls, the damage range was 5.4-6.1 holes / sheet; while after a second application of IJs, significant differences were detected among the treatments, whose average damage range was 26.4 -42 holes / sheet. These detected differences added to the collection of adults of P. muriceus infected with H. bacteriophora, allowed to determine the effectiveness of this nematode on the control of this pest. In turn, soil samples were evaluated monthly in order to know the persistence and dispersion of the IJs applied in this crop. From the data obtained, it was observed that two months after the application, the IJs were dispersed to the plots assigned as controls, located 3 meters from the application points. This could be due in part to the active movement of NEPs, and in turn, to passive movements, through infected hosts, forestry and water. From the soil samples processed it was possible to verify that during seven months the nematode could persist in the environment, which could be due to the tolerance of the larvae to the desiccation and / or to the infection of new hosts. However, the dispersion was lower than that registered in the strawberry crop. This could be due to an insufficient distribution of moisture throughout the crop given the type of irrigation used, which is carried out by flooding furrows, whose efficiency can be so low that it can reach less than 40% of the crop. The obtained results would indicate that H. bacteriophora SUP, could be a potential control agent of P. muriceus, given the susceptibility demonstrated in laboratory conditions, the reduction of the foliar damage registered in the field in the treatments carried out, and the recovery of specimens infected with the applied nematode. Heterorhabditis bacteriophora SUP represents the first record of an entomopathogenic nematode associated with tomato crops in the Cinturón Hortícola Platense (CHP), adding to the list of natural enemies present in this crop, considering itself as a potential control agent of coleoptera pests. The results showed its potential as a biocontroller of different agricultural pests, due to the feasibility of production in the laboratory to the capacity of infection, establishment and dispersion under natural conditions in two different agroecosystems.