Evaluación de parámetros somáticos, neurobiológicos y de la función reproductora en diversas etapas cronológicas de ratones con ingesta variable de ácidos grasos omega 3

Abstract

Los ácidos grasos poliinsaturados (PUFA) se encuentran ampliamente distribuidos en los tejidos del organismo y participan en su fisiología a través de diferentes mecanismos. Son los principales componentes estructurales de las membranas celulares, regulando la composición y fluidez de las mismas y la actividad de sus proteínas. Además, se desempeñan como precursores y reguladores de la síntesis de sustancias biológicamente activas y tienen capacidad de modificar la expresión genética por mecanismos que incluyen los epigenéticos.Estudios en humanos y animales dan cuenta de que la oferta alimentaria de PUFA omega (ω) 3, así como la relación ω6/ω3, son relevantes para el crecimiento-desarrollo fetal y postnatal a la vez que tienen repercusiones sobre la función cerebral y reproductiva. Sin embargo, algunos resultados son inconsistentes a la vez que existen áreas de vacancia al considerar los efectos sobre ciertas variables in vivo y los respectivos mecanismos involucrados.En el presente trabajo estudiamos la influencia de la exposición a diferentes niveles dietéticos de PUFA ω3, desde la gestación hasta la adultez, sobre parámetros de desarrollo somático, neurobiológico y reproductivo. Tres grupos de ratones hembras albino Swiss -durante gestación y lactancia- y luego sus crías -desde destete hasta adultez- fueron alimentados con C (dieta purificada -DP- control, adecuada en ω3; 7% aceite de soja; ω3: 0,57%; ω6/ω3: 5,7), D (DP deficiente en ω3; 7% aceite de girasol; ω3: 0%; ω6/ω3: 0) o E (DP excesiva en ω3; 7% aceite mezcla: hígado de bacalao 60% + soja 40%; ω3: 1,25%; ácido eicosapentaenoico: 0,43%; ácido docosahexaenoico -DHA-: 0,32%; ω6/ω3: 1,29).Los diferentes niveles de PUFA ω3 en la dieta materna no afectaron el peso al nacer ni otras variables relacionadas con la gestación. Sin embargo, la dieta E produjo menor peso y longitud corporal de las crías durante la lactancia, mientras que la D, solo menor longitud en este mismo período. A pesar de que las variaciones persistieron luego del destete, todos los grupos alcanzaron similar longitud al llegar a la adultez (día postnatal -DPN- 63). El peso corporal de E fue superior a D desde el DPN 49 al 56 en machos y hembras pero estas últimas presentaron peso similar en el DPN 63, mientras que la diferencia se mantuvo para los machos. Respecto a los indicadores de desarrollo, el porcentaje de crías con apertura palpebral positiva en el DPN 14 fue menor en E y se observó un retraso en el inicio de la pubertad en las hembras de este mismo grupo. La evaluación seminal en machos adultos demostró en D un mayor porcentaje de espermatozoides acodados (vs. C) y con ambos signos de inmadurez (vs. C y E).Al considerar la influencia de los PUFA ω3 sobre la ansiedad y la actividad locomotora, los hallazgos más relevantes en el plus maze fueron un mayor porcentaje de entradas a los brazos abiertos (BA) y de tiempo de permanencia sobre los BA registrado en el grupo E vs. C. En el open field, D presentó aumento del número de cruces de líneas periféricas y del índice de locomoción y2disminución del número de cruces de líneas centrales. Finalmente, en los estudios moleculares se observó en el grupo D vs. C y E un mayor nivel del mensajero para arginina vasopresina (AVP) hipotalámica y de su receptor hipofisario AVPr1b y un menor nivel del gen para el receptor de glutamato ácido n-metil D-aspártico (NMDA) isoforma 1 en hipocampo. En esta última estructura, E respecto a C presentó mayor expresión del gen de la proteína que se une al elemento de respuesta al AMPc (CREB) isoforma 1a.El exceso de metabolitos ω3 puede limitar la síntesis de ácido araquidónico (AA) reduciendo drásticamente el nivel de las prostaglandinas derivadas del mismo. El retraso en el crecimiento de E durante la lactancia puede ser explicado por este mecanismo, capaz de afectar el desarrollo de los ductos mamarios y por lo tanto, la cantidad y calidad de la leche ofrecida a las crías. Asimismo, ha sido demostrado que el AA es necesario para el desarrollo del tejido adiposo y el crecimiento tisular. Además, la exposición intrauterina a niveles excesivos de ω3 puede alterar el reflejo de succión de las crías por mecanismos neurotóxicos. Otras alteraciones atribuibles al exceso de PUFA ω3 y la deficiencia relativa de AA, son el retraso en la apertura bipalpebral de la camada y en el inicio de la pubertad en las hembras. La recuperación del crecimiento de las crías luego del destete y la ausencia de diferencias en los parámetros reproductivos al llegar a la adultez, sugiere la presencia de mecanismos compensatorios. El mayor recuento de espermatozoides inmaduros en D podría deberse a la ausencia de los efectos que los ω3 tienen sobre la maduración de las membranas y/o a alteraciones en el estado redox que limitan la formación de puentes disulfuro. En lo que a la respuesta conductual de ansiedad se refiere, el exceso de PUFA ω3 provoca un comportamiento ansiolítico en el plus maze. Los niveles de PUFA ω3 modifican selectivamente la función del eje hipotálamo-hipófiso-adrenal. Los niveles de expresión de los genes de AVP y su receptor AVPr1b fueron superiores en D vs. C y E, sugiriendo que el déficit de ω3 induce una conducta de tipo depresiva, especialmente la asociada con hiperactividad, resultados que son reforzados por la prueba conductual de open field, en la que D muestra una conducta hiperlocomotora y una respuesta de tipo ansiosa. Sin embargo, la expresión central del gen para hormona liberadora de corticotropina (CRH) y sus receptores CRH 1 y 2, así como las concentraciones hormonales de corticosterona plasmática no mostraron variaciones entre los grupos.Por otra parte, numerosos estudios han reportado que los niveles de PUFA ω3 tienen efecto sobre la memoria. Nuestros hallazgos permiten postular a NMDA1 y CREB1a como posibles intermediarios a través de los cuales esta familia de PUFA de la dieta modulan la neuroplasticidad y la expresión conductual de la memoria, dado que NMDA es un receptor de membrana que participa en la activación de la cascada de señales estudiada y CREB, un factor de transcripción nuclear cuyo aumento mejora la adquisición y persistencia de la memoria a largo plazo dependiente de hipocampo.

Polyunsaturated fatty acids (PUFA) are widely distributed in the body tissues and participate in their physiology through different mechanisms. They are the main structural components of cell membranes, regulating their composition, fluidity and the activity of membrane‐associated proteins. They are also precursors for, and regulators of, the synthesis of biologically active substances and can modify epigenetic processes and genetic expression. Studies in humans and other animals show that the dietary consumption of omega (ω) 3 PUFA, as well as the ω6/ω3 ratio, is important for the fetal and postnatal growth and development, with impact on the brain and reproductive function. However, some results are inconsistent and there are areas of vacancy when considering their effects on certain in vivo variables and the respective involved mechanisms. In the present work, we studied the influence of exposure to different dietary levels of ω3 PUFA, from gestation to adulthood, on parameters related to somatic, neurobiological and reproductive development. Three groups of female albino Swiss mice ‐during gestation and lactation‐ and then their offspring ‐from weaning to adulthood‐ were fed with C (control purified diet ‐PD‐, adequate in ω3; 7% of soybean oil; ω3: 0.57%; ω6/ω3: 5.7), D (ω3 deficient PD; 7% of sunflower oil; ω3: 0%; ω6/ω3: 0%) or E (ω3 excessive PD; 7% of blend oil: 60% cod‐liver + soybean 40%; ω3: 1.25%; eicosapentaenoic acid: 0.43%; docosahexaenoic acid ‐DHA‐: 0.32%; ω6/ω3: 1.29). The different levels of ω3 PUFA in the dams’ diet did not affect maternal and birthing outcomes. However, E diet produced a reduction in the offspring body weight and length during lactation, while D diet only reduced the length in the same period. After weaning (postnatal day (PND) 21), D and E offspring were shorter than C offspring. Despite these variations, all groups reached equal length at adulthood (PND63). From PND49 to PND56, E animals weighed more than D animals, but this difference disappeared for E female pups on PND63. Regarding development, the percentage of eye opening on PND14 was lower in E pups than C and D pups. Puberty onset was significantly delayed in E female offspring. Seminal evaluation in adult male offspring showed a greater percentage of bending sperm and with both signs of sperm immaturity (bending and cytoplasmic droplet) in the D group. Considering the influence of ω3 PUFA on anxiety and locomotion, the most relevant findings in the plus maze were a higher percentage of entries to open arms (OA) and time spent on the OA in E group vs. C group. In the open field test, animals exposed to D diet presented an increase of the peripheral line crossing number and locomotion index and a decrease of the central line crossing number. Finally, in molecular studies, a higher gene expression of the hypothalamic arginine vasopressin (AVP) and its pituitary receptor AVPr1b and a lower gene expression of the hippocampal glutamate N‐methyl D‐aspartate (NMDA) isoform 1 were observed in D offspring vs. C and E offspring. In hippocampus, E animals presented a greater gene expression of the AMPc element binding protein (CREB) isoform 1a than C animals. The excess of ω3 metabolites can limit arachidonic acid (AA) synthesis, reducing the level of eicosanoid metabolic products from this PUFA. The delay in the growth of E during lactation can be explained by this mechanism, able to affect the development of mammary ducts and therefore, the quantity and quality of the milk offered to the pups. It has also been demonstrated that AA is necessary for adipose tissue development and general tissue growth. In addition, intrauterine exposure to excessive levels of ω3 PUFA may alter the pups’ suckling reflex by neurotoxic mechanisms. Other alterations attributable to the ω3 PUFA excess and the relative deficiency of AA are the delay in eye opening of the litter and the onset of puberty in females. The E pup growth recovery after weaning and the absence of differences in reproductive parameters when reaching adulthood suggest the existence of compensatory mechanisms. The greater percentage of immature sperm in the ω3 PUFA deficient group could be attributed to alterations in membrane maturation and/or to a redox imbalance that limits protein disulfide bridge events to complete the sperm shaping. Regarding anxiety behavioral response, the ω3 PUFA excess provokes an anxiolytic‐ like behavior in the elevated plus maze. The ω3 PUFA levels selectively modified the function of the hypothalamus‐pituitary‐adrenal axis. The higher expression of AVP genes and its receptor AVPr1b in D suggests that ω3 PUFA deficiency induces a depressive behavior, especially associated with hyperactivity, results that are reinforced by the open field behavioral test, in which D shows a hyperlocomotor behavior and an anxiogenic‐like behavior. However, the central expression of the gene for adrenocorticotropic releasing hormone (CRH) and their receptors CRH 1 and 2, as well as plasma corticosterone concentrations did not show variations between groups. Finally, numerous studies have reported that dietary ω3 PUFA levels have effects on memory. Our findings allow applying NMDA1 and CREB1a as possible intermediaries through which this family of dietary PUFA modulates neuroplasticity and the memory behavioral expression, because NMDA is a membrane receptor that is involved in the activation of the molecular cascade of memory and CREB, a nuclear transcription factor that improves the acquisition and persistence of the hippocampus‐dependent long‐term memory.