Caracterización del rol de la proteína de unión a ARN TbRRM1 de Trypanosoma brucei

Abstract

Dado que la transcripción en Tripanosomátidos es policistrónica, la regulación de la expresión génica en estos organismos se da principalmente a nivel post-transcripcional mediante proteínas de unión a ARN. Nuestra proteína de estudio, TbRRM1, presenta tres dominios RRM de unión a ARN y forma parte del grupo de proteínas SR-relacionadas. Previamente, se ha demostrado en nuestro laboratorio que TbRRM1 es esencial para la sobrevida en el estadio procíclico de Trypanosoma brucei ya que su silenciamiento por ARNi afecta la curva de crecimiento y produce morfologías aberrantes. En este trabajo, se propuso caracterizar a la proteína de unión a ARN TbRRM1 y estudiarla como posible blanco terapéutico para el tratamiento de las Tripanosomiasis. Para ello, se generó un sistema estable para el silenciamiento inducible de TbRRM1 en el estadio sanguíneo de T. brucei. Los resultados demostraron que, al igual que en el estadio procíclico, TbRRM1 resultaesencial en el estadio del mamífero ya que su silenciamiento produce unadisminución en la curva de crecimiento. Además, se demostró que la muerte de los parásitos se produce por un mecanismo compatible con apoptosis en ambos estadios de T. brucei. Los estudios de la cuantificación de núcleos y kinetoplastos en ambos estadios junto con el análisis del ciclo celular por marcación con ioduro de propidio y citometría de flujo demostraron queTbRRM1 es necesaria para la progresión normal del ciclo celular. Además, el silenciamiento de TbRRM1 en el estadio sanguíneo produjo la aparición de parásitos con flagelo desprendido y de células conectadas por su extremo posterior, lo que indica que TbRRM1 es necesaria para la correcta citoquinesis. Por otra parte, se evaluaron los efectos de la sobreexpresión de TbRRM1 en el estadio procíclico y se determinó que la elevada sobreexpresión de la proteína produce un fenotipo letal similar al observado luego del silenciamiento de TbRRM1.Mediante los ensayos llevados a cabo en esta Tesis Doctoral, se caracterizó a la proteína de unión a ARN TbRRM1 demostrando que es esencial para la sobrevida en ambos estadios de T. brucei. Además, dado que TbRRM1 es esencial para el parásito y que no posee ortólogos en humanos, puede ser considerada un blanco potencial para el desarrollo de drogas que permitan mejorar la calidad de vida de pacientes que padecen enfermedades causadas por Tripanosomátidos

Since transcription in Trypanosomatids is polycistronic, regulation of gene expression in these organisms occurs mainly at post-transcriptional level by RNA binding proteins. Our protein of interest, TbRRM1 has three RRM RNA binding domains and is a member of the group of SR-related proteins. Previously, it has been shown in our laboratory that TbRRM1 is essential for survival in the procyclic form stage of Trypanosoma brucei since its silencing by RNAi affects the growth curve and produces aberrant phenotypes. This study aimed to characterize the TbRRM1 RNA binding protein and study it as a possible therapeutic target for the treatment of Trypanosomiasis. For this purpose, a stable system was generated for the inducible silencing of TbRRM1 in the bloodstream form stage. The results showed that, as in the procyclic stage, TbRRM1 is essential for the mammalian stage since its silencing produces a decrease in the growth curve. In addition, it was demonstrated that the parasite death occurs by a mechanism compatible with apoptosis in both stages of T. brucei. The quantification of nuclei and kinetoplasts in both stages together with the analysis of the cell cycle by propidium iodide and flow cytometry showed that TbRRM1 is necessary for the normal progression of the cell cycle. In addition, silencing of TbRRM1 in the bloodstream form stage of T. brucei produced the appearance of parasites with flagellum detachment and cells connected by their posterior end, indicating that TbRRM1 is necessary for cytokinesis. On the other hand, the effects of overexpression of TbRRM1 in the procyclic stage were evaluated and it was determined that the high overexpression of the protein produces a lethal phenotype similar to that observed after the silencing of TbRRM1. Through the research carried out in this Thesis, TbRRM1 RNA binding protein was characterized, having demonstrated that it is essential for survival in both stages of T. brucei. Moreover, given that TbRRM1 is essential for the parasite and that it does not have orthologs in humans, it can be considered a potential target for the development of drugs that improve the quality of life of patients suffering from diseases caused by Trypanosomatids.