Relación entre la estructura y la función de M6a: endocitosis y reciclado

Abstract

La glicoproteína de membrana M6a se encuentra asociada a enfermedades neuropsiquiátricas como la depresión, la esquizofrenia y fallas en el aprendizaje. Se ha descripto que contribuye positivamente en la extensión de neuritas, el crecimiento axonal la formación de filopodios/espinas y el mantenimiento de las sinapsis. M6a posee cuatro pasos de transmembrana, dos bucles extracelulares, uno mayor (EC2) y uno menor (EC1) y los extremos citoplasmáticos hacia el interior celular. Dos cisteínas presentes en su EC2, que forman un puente disulfuro, mostraron ser esenciales para el reconocimiento antigénico del anti-M6a-mAb. Este anticuerpo fue descripto como neutralizante porque ha sido capaz de bloquear la extensión de neuritas mediada por M6a. Por otro lado, se ha determinado, por coinmunoprecipitación, que M6a interactúa directa o indirectamente con clatrina. Sin embargo, el mecanismo preciso por el cuál M6a se internaliza y se recicla aún no ha sido dilucidado. En este trabajo, utilizando ensayos in vitro controlados estudiamos la inmunointernalización de M6a mediada por el anti-M6a-mAb. Observamos que luego de una hora de tratamiento parte de M6a se endocita y disminuyen significativamente el número de sinapsis en neuronas de hipocampo. Cuando los niveles de M6a en la superficie celular se reestablecen, observamos que el número de sinapsis recobra sus valores normales. La internalización de M6a involucra a endosomas tempranos revestidos de clatrina. Probablemente ésta ocurra por la asociación entre la proteína adaptadora 2 y el “motivo basado en tirosina” 251YEDI254 ubicado en el extremo C-terminal de M6a. Luego de su endocitosis, M6a es dirigida hacia endosomas tempranos característicos, Rab5- y EEA1-positivos. Posteriormente es dirigida o bien hacia la membrana a través de endosomas Rab11 positivos o bien hacia la vía degradativa mediada por endosomas Rab7 y LAMP-1 positivos. Nuestros resultados muestran que los niveles de M6a en la superficie celular neuronal modifican la formación y mantenimiento de las sinapsis, sin alterar los niveles de proteicos de las proteínas sinápticas estudiadas (sinaptofisina y el receptor de alta afinidad por glutamato, N-metil-D-aspartato receptor tipo 1). Este mecanismo novedoso podría ser relevante durante el desarrollo neuronal, el podado sináptico y/o podría estar involucrado en diversos desórdenes neurológicos en donde la sinapsis se encuentra comprometida.

The neuronal glycoprotein M6a has been associated with psychiatric disorders such as, depression, learning disabilities and schizophrenia. In cultured neurons, M6a positively contributes to neurite extension, axon guidance, filopodia/spine outgrowth, and synapse formation. The endocytic processes of neuronal membrane proteins are linked to the differentiation, growth, signalling and plasticity of neurons. However, the roles of M6a and the precise mechanisms through which M6a internalizes and recycles back to the neuronal membrane are unknown. Here, by using a controlled in vitro assay, we showed whether M6a is endocytosed, the number of synapses in hippocampal neurons decreases. When re-establishing the levels of M6a at the cell surface, the number of synapses returned to its normal values. M6a internalization involves clathrin-coated pits, probably by the association between the adaptor protein 2 and the 251YEDI254 “tyrosinebased” motif located within the C-tail of M6a. Upon endocytosis, M6a is sorted to early endosome antigen 1- and Rab5-positive endosomes and, then sorted back to the cell surface via Rab11-positive endosomes or to degradation via Rab7 and, finally LAMP-1- positive endosomes. Our results demonstrated that the levels of M6a at the cell surface modified the formation/maintenance of synapses, without altering the protein levels of synaptophysin or N-methyl-D-aspartate receptor type-1. This novel mechanism might be relevant during neuronal development, pruning and/or many of the mental disorders in which the number of synapses is affected.