Determinación por métodos multiresiduo de plaguicidas y micotoxinas en alimentos vegetales y lácteos mediante técnicas cromatográficas-espectrométricas de masa

Abstract

La calidad de los alimentos consumidos por el ser humano y por los animales está determinada, entre otros, por dos factores que tienen lugar al inicio de la cadena de producción. Por un lado, la expansión agrícola influye como consecuencia del gran número de plaguicidas que se utilizan en la agricultura como herramientas para el control de plagas y para incrementar los rendimientos de los cultivos. Por otro lado, los procesos de intensificación de la producción animal requieren de disponer gran cantidad de alimentos conservados que se almacenan en condiciones muy variables y son propensos al desarrollo fúngico y la producción de un gran número de micotoxinas. La combinación de ambos, los plaguicidas y las micotoxinas, puede afectar no solamente la salud y la producción de los animales que son los primeros expuestos, sino eventualmente también a las personas que consumen alimentos producidos por esos animales, como la leche. El control de materias primas y productos en la etapa inicial de la cadena de producción es, por lo tanto, de importancia fundamental.Las actividades desarrolladas para la concreción de la presente tesis estuvieron enmarcadas en dos proyectos de investigación interdisciplinares. Uno denominado ?Residuos y contaminantes en cadenas de agroalimentos prioritarias de la región central santafesina? (Proyecto ANPCyT-PICT) cuyo objetivo principal era generar y perfeccionar métodos avanzados para la determinación de plaguicidas y contaminantes fúngicos, y aplicarlos en estudios de residualidad en muestras de leche cruda y alimentos vegetales para ganado. El otro fue un proyecto de cooperación binacional Argentina-República Checa denominado ?Técnicas analíticas innovadoras para la evaluación de inocuidad de alimentos y piensos? (Proyecto MINCyT-MEYS) uno de cuyos objetivos era la aplicación de metodologías multi-residuo multi-clase de amplio espectro para efectuar estudios de campo sobre la transferencia de micotoxinas y plaguicidas desde los alimentos consumidos por el ganado hacia la leche.En ese contexto, luego de una introducción general el presente manuscrito se organizó en 4 capítulos principales. Los Capítulos 2 y 3 tienen una componente principal de índole químico-analítica centrada en la matriz leche destinada a la obtención de métodos multi-residuo multi-clase para la determinación de micotoxinas y plaguicidas en ese alimento y su aplicación en un estudio de campo (Proyecto ANPCyT-PICT). Los Capítulos 4 y 5, centrados en piensos como matrices de estudio, no focalizan en el desarrollo de metodologías analíticas sino en la aplicación de métodos de amplio espectro para evaluar la incidencia de la residualidad de dichos contaminantes en una diversidad de alimentos que componen la dieta del ganado lechero en la zona central de Argentina (Proyecto MINCyT-MEYS).El Capítulo 2 describe, en una primera parte, la optimización y validación de una metodología basada en columnas de inmunoafinidad con cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masa (IAC-UHPLC-MS/MS) para la determinación de aflatoxina M1 en leche y su aplicación para el análisis de 160 muestras de leche tomadas de 40 establecimientos productores de la zona central de la Provincia de Santa Fe durante 4 estaciones climáticas a lo largo de un año. Se encontró una prevalencia de AFM1 en las muestras analizadas cercana al 50% con niveles medios de concentración de 0,038 y un máximo de 0,293 µg/L. Aunque no se registraron excesos en el límite máximo establecido en Argentina (0,5 µg/L) se verificaron violaciones al LM de la Unión Europea (0,05 µg/kg) en el 8% de las muestras. En la segunda parte del Capítulo se describe la optimización de una metodología alternativa al método IAC basada en el enfoque QuEChERS para integrar la determinación de AFM1 con la de residuos de plaguicidas en un mismo método de extracción. Tras varias etapas de optimización, el método propuesto mostró un desempeño analítico con cifras de mérito compatibles con las normativas de Mercosur y la Unión Europea.El Capítulo 3 describe la optimización y validación de una metodología QuEChERS-UHPLC-MS/MS para la determinación multi-residuo multi-clase de residuos de plaguicidas y micotoxinas en leche, y su posterior aplicación en al análisis de 80 muestras de leche tomadas de los mismos establecimientos referidos anteriormente durante dos períodos climáticos. El método optimizado demostró parámetros de desempeño que satisfacen los requerimientos de las normativas de Argentina y de otros países. En el análisis de muestras de leche se encontró mayor prevalencia de insecticidas organofosforados como clorpirifos y diazinon, y en menor medida otros como atrazina, acetamiprid, carbendazim, pirimifos-metilo, entre otros. Adicionalmente, la posterior incorporación de un instrumento GC-MS/MS en las instalaciones del PRINARC permitió analizar los extractos de las mismas muestras ampliando así el conjunto de compuestos determinados. De esa forma, se encontraron también residuos de plaguicidas organoclorados como heptacloro o isómeros de DDT, prohibidos hace más de dos décadas, y una alta ocurrencia de endosulfán-sulfato, de prohibición más reciente en Argentina.En el Capítulo 4 se describe la determinación de residuos de plaguicidas en una amplia variedad de piensos que componen las dietas del ganado lechero. La estrategia analítica orientada a enfoques de amplio espectro consistió en la determinación de 350 compuestos mediante una metodología analítica QuEChERS-UHPLC-MS/MS (análisis realizado en República Checa) y la posterior determinación de 160 plaguicidas en las mismas muestras replicando el procedimiento de extracción pero con determinación por GC-MS/MS (análisis realizado en Argentina). De los 420 plaguicidas estudiados en total 50 se encontraron en las muestras analizadas, siendo el 62% insecticidas, el 20% herbicidas y el 18% restante fungicidas. Clorpirifos, metolacloro y difenilamina fueron los plaguicidas de mayor ocurrencia entre los insecticidas, herbicidas y fungicidas, respectivamente. Respecto al análisis de muestras, en el 72% de las mismas se encontraron residuos de plaguicidas (n=54), siendo los alimentos balanceados y las semillas de algodón las matrices con mayor cantidad de compuestos detectados. La concentración más alta de un plaguicida hallado fue para el insecticida piretroide deltametrina en un alimento balanceado (532 µg/kg).En el Capítulo 5 se describe la determinación de micotoxinas en el mismo set de muestras de alimentos vegetales analizadas en el Capítulo 4 y a partir del mismo procedimiento de extracción, integrando así la determinación simultánea de gran cantidad de compuestos (multi-residuo) de diferente origen (multi-clase). A partir del mismo extracto QuEChERS utilizado en el análisis de residuos de plaguicidas, se determinó un conjunto de 56 metabolitos fúngicos incluyendo micotoxinas tradicionales, conjugadas o enmascaradas, y micotoxinas emergentes. Se encontró que el 100% de las muestras analizadas contenía al menos 1 micotoxina, y del total de compuestos incluidos en el alcance del método se identificaron 38 (68%). Además de las micotoxinas con incidencia histórica en este tipo de alimentos en la región (aflatoxinas, fumonisinas, zearalenona, deoxinivalenol), se hallaron micotoxinas emergentes como eniantinas, toxinas de Alternaria y beauvericina que no habían sido previamente estudiadas. En algunos casos de verificaron excesos a los límites máximos establecidos por la UE para micotoxinas en piensos, como AFB1 en granos de maíz (LM=5 µg/kg), FB1 en gluten de trigo (LM=6000 µg/kg) y ZEA en silaje de maíz (LM=3000 µg/kg). Los resultados obtenidos en este trabajo constituyen un aporte importante para un mayor conocimiento sobre la residualidad de plaguicidas y micotoxinas en la primer etapa de la cadena de producción, y pueden ayudar a asistir a los productores respecto al mejoramiento del manejo de sus cultivos y productos almacenados destinados a la alimentación animal, para perfeccionar los programas de monitoreo y control necesarios para la evaluación de riesgo, y para asegurar las medidas de protección de la salud tanto animal como humana relacionadas con la inocuidad de los alimentos.

Among several factors, food and feed quality for human and livestock consumption is determined by two main circumstances occurring at the beginning of the food chain. On one hand, agricultural expansion demands a high number of pesticides to be used for crop protection and to improve crops yields and this might impact on food and feed quality. On the other hand, farm feeding intensification in livestock production demands higher amounts of conserved forages and concentrated feeds which may be exposed to fungal development and mycotoxin contamination as a consequence of inappropriate storage conditions. Combination of both pesticide residues and mycotoxins could affect not only animal health and production, but eventually human health also, due to consumption of contaminated products of animal origin. The control of commodities and raw primary foods at the beginning of the food supply chain is, hence, of priority importance. The activities involved in the realization of this thesis where framed under two interdisciplinary research projects. One of them, named “Residues and contaminants in priority agrifood supply chains from Santa Fe central region” (ANPCyT-PICT Project) was aimed to develop and perfect advanced analytical methods for the determination of pesticides and fungal contaminants, and to apply them in residuality studies on raw milk and feedstuff samples for dairy cattle. The second project named “Novel analytical techniques for food and feed safety assessment” was a binational cooperation project between Argentina and the Czech Republic and was aimed to the application of wide-scoped multi-residue multi-class methodologies for field studies assessments regarding mycotoxin and pesticide transfer from feed consumed by dairy cattle to milk. In this context, this manuscript was organized in 4 main chapters after a general introduction about the different addressed topics. Chapters 2 and 3 have a main chemical-analytical component focused on milk as the studied matrix and are aimed to the development of multi-residue multi-class methods for the determination of mycotoxins and pesticide residues with further application to field studies (ANPCyT-PICT Project). Centered in vegetal origin feedstuffs analysis, Chapters 4 and 5 are not focused on analytical methodologies developments but on their application of wide-scoped approaches to assess mycotoxin and pesticide residuality on a great variety of typical feed that constitute dairy cattle diets in Argentinean central regions (MINCyT-MEYS Project). Chapter 2 describes, at a first stage, the optimization and validation of an immunoaffinity-based extraction method with liquid chromatography-tandem mass spectrometry determination (IAC-UHPLC-MS/MS) for aflatoxin M1 determination in raw milk and its application for the analysis of 160 milk samples obtained from 40 different milk farms located in Santa Fe province central region throughout four climate season in a one-year field study. AFM1 prevalence in the analyzed samples was close to 50% with mean and maximum concentration levels of 0.038 and 0.293µg/L, respectively. Although no maximum limits violations to Argentinean legislation (0.5µg/L) were observed, European Union ML (0.05µg/L) exceedances were observed in 8% of the cases. Chapter 2 second part describes the optimization of a QuEChERS-based approach as an alternative to the IAC method to integrate AFM1 and pesticide residues determination in a single extraction method. After several optimization steps, the proposed method was validated demonstrating appropriate analytical performance to fulfill Mercosur and European Union legislations. Chapter 3 describes the optimization and validation process of a QuEChERS-UHPLC-MS/MS for the multiresidue multi-class determination of pesticides and mycotoxins in milk, and its later application to the analysis of 80 milk samples obtained from the same above mentioned dairy farms. The optimized method demonstrated good performance characteristics to fulfill analytical requirements set by legislation from Argentina and other countries. The analysis of milk samples revealed a higher prevalence of organophosphate insecticides (mainly chlorpyrifos and diazinon) and to a less extent other compounds such as atrazine, acetamiprid, carbendazim and pirimifos-methyl were also found. In addition, the later incorporation of a GC-MS/MS system to the PRINARC analytical platforms allowed the analysis of the same sample extracts to enhance the determined compounds scope. Thus, residues of some organochlorine pesticide that have been banned for over 2 decades were found such as heptachlor and DDT isomers, and also high occurrence of endosulfan-sulfate which has been more recently banned. Chapter 4 describes the pesticide residues determination in a wide variety of feed samples used in dairy cattle diets. In this case the analytical strategy was focused on wide-scoped approaches and it implied the determination of 350 compounds my means of a QuEChERS-UHPLC-MS/MS analytical methodology (analysis performed in the Czech Republic) together with the further determination of 160 pesticides in the same samples by replicating the extraction procedure but with final determination by GC-MS/MS (analysis performed in Argentina). From the total 420 different pesticides studied 50 of them were found in the analyzed samples, being 62% of them insecticides, 20% herbicides and 18% fungicides. Chlorpyrifos, metholachlor and diphenylamine were the pesticides with major occurrence from the insecticide, herbicide and fungicide families, respectively. Regarding sample analysis, pesticide residues were found in 72% of them (n=54), being compound feeds and cotton seeds the feed types with higher amount of detected compounds. The highest concentration of a single pesticide in an individual sample was due to the pyrethroid insecticide deltamethrin in a compound feed sample (532µg/kg). Chapter 5 describes the mycotoxin determination in the same set of feed samples analyzed in Chapter 4, using the same extraction procedure thus integrating simultaneous determination of a great amount of compounds (multi-residue) from different classes and origin (multi-class). From the same sample extracts used for pesticide residues analysis, 56 fungal origin metabolites were determined, including traditional mycotoxins, conjugated or masked mycotoxins and emerging mycotoxins. All of the analyzed samples (100%) evidenced contamination with at least one mycotoxin, and from the total compound included in the analytical scope 38 different mycotoxins were identified (68%). Besides mycotoxins with historical incidence in this types of feed from the studied region (like aflatoxins, fumonisins, zearalenone and deoxynivalenol), other emerging mycotoxins that had not previously been studied were found, such as enniatins, Alternaria toxins and beauvericin. In some cases violations to EU maximum levels for mycotoxins in feeds were observed, as the case of AFB1 in maize grains (ML=5 µg/kg), FB1 in wheat gluten (ML=6000 µg/kg) and ZEA in maize silage (ML=3000 µg/kg). The results obtained from this work constitute an important contribution for a better knowledge about mycotoxin and pesticide residuality in the first stage of the food production chain, and can help to assist producers on the improvement of crops and feed managements, to improve monitoring and control programs for risk assessment and to guarantee safe food and feeds for human and animal health protection.