Mecanismos de toxicidad de nanopartículas de plata en organismos acuáticos

Abstract

La creciente producción y utilización de las nanopartículas de plata (AgNP) por sus eficientes propiedades biocidas llevan a su liberación en los ambientes en cantidades desconocidas, siendo los sistemas acuáticos los sumideros finales. El objetivo general de este estudio fue comprender los mecanismos de toxicidad de las AgNP en organismos acuáticos. Para ello, llevamos a cabo ensayos in vivo y ex vivo (branquias) con peces de agua dulce y moluscos marinos. Se seleccionaron concentraciones de AgNP bajas y ambientalmente relevantes a partir de un stock comercial de nanoplata coloidal (Nanotek S.A., nanArgen®).Un primer ensayo consistió en la exposición in vivo de juveniles de peces Porchilodus lineatus (sábalo) a: 0 (control); 2.5 y 25 µg AgNP L-1 (renovaciones cada 48 h) durante 5 y 15 días. La acumulación de Ag total en los tejidos aumentó ante ambas concentraciones y tiempos de exposición según la siguiente secuencia: hígado>branquias>intestino>cerebro. El índice hepatosomático de los peces aumentó luego de ambos tiempos de exposición en el caso de la concentración de 25 µg AgNP L-1. Respecto a las mediciones hematológicas, después de 5 días aumentó la cantidad de glóbulos rojos, los niveles de concentración media de hemoglobina corpuscular y la cantidad de monocitos; mientras que pasados los 15 días de exposición aumentó la cantidad de glóbulos blancos y monocitos, y disminuyeron la hemoglobina corpuscular media y la cantidad de linfocitos. En el mucus aislado de la superficie corporal de los peces expuestos por 15 días a ambas concentraciones de AgNP, se observó una disminución de la cantidad de unidades formadoras de colonias de bacterias. En cuanto a los marcadores de estrés oxidativo, en el hígado de los peces hubo un aumento de todas las enzimas antioxidantes (superóxido dismutasa, catalasa -CAT-, glutatión S-transferasa -GST-, glutatión reductasa y glutatión peroxidasa) y disminución de la capacidad antioxidante luego de 15 días. Contrariamente, en las branquias se evidenció una inhibición de todas las enzimas luego de 5 días a 25 µg AgNP L-1, y peroxidación lipídica (LPO) a los 15 días de exposición. Además, luego de la exposición a la mayor concentración de AgNP se observaron alteraciones en los marcadores de costo energético: la glucosa y proteínas (Prot) plasmáticas aumentaron luego de 5 días, y el glucógeno hepático y muscular, y las Prot del músculo después de 15 días. Por otro lado, el análisis histológico de las branquias de los sábalos reveló una mayor cantidad de histopatologías y proliferación de células mucosas luego de 15 días a 25 µg AgNP L-1, lo cual sumado a la alteración de enzimas transaminasas deja en evidencia un severo daño de este órgano vital. Por último, se llevó a cabo un análisis multivariado que brindó una visión holística de los resultados, y claramente separó y demostró un perfil fisiológico diferente de los peces expuestos a 25 µg AgNP L-1 por 15 días. Además, ordenó los ejemplares según los diferentes tiempos de exposición.Por otra parte, se llevó a cabo un ensayo ex vivo con branquias de juveniles de peces Piaractus mesopotamicus (pacú) y adultos de Corydoras paleatus (quitasueños) para exponerlas (empleando una solución salina como medio) a AgNP y AgNO3. Se analizaron efectos tóxicos a través de biomarcadores de estrés oxidativo, y a la vez posibles mitigaciones de los mismos cuando estaban presentes ácidos húmicos (AH) en el medio. Los tratamientos fueron: solución salina (control); solución salina + 10 mg AH L-1 (control AH); 100 µg AgNP L-1; 100 µg AgNP L-1 + 10 mg AH L-1; 100 µg AgNO3 L-1; 100 µg AgNO3 L-1 + 10 mg AH L-1. Luego de 1 h de exposición, en las branquias de pacú hubo un aumento de la actividad de la enzima antioxidante CAT en los tratamientos con AgNP y la sal de plata. Por su parte, en las branquias del quitasueños se vieron disminuidos los niveles de glutatión y la actividad de la enzima GST en el caso de la exposición a AgNO3, y también aumentaron los niveles de LPO luego de la exposición a AgNP. Todos los efectos fueron atenuados cuando estaban presentes los AH en el medio. Por último, se desarrolló un ensayo in vivo con el molusco marino Mytilus galloprovincialis como organismo test, el cual fue expuesto a: 0 (control), 1 µg AgNP L-1 y 10 µg AgNP L-1 (renovaciones cada 24 h) durante 96 h. Los resultados demostraron un aumento en la acumulación Ag en el tejido blando del bivalvo. Los hemocitos revelaron una disminución de la estabilidad de las membranas lisosomales luego de ambas concentraciones de AgNP, y un aumento de la frecuencia de micronúcleos. En la glándula digestiva se evidenció un aumento de la actividad enzimática de GST y de los niveles de LPO. Los niveles de metalotioneínas aumentaron en caso de la exposición a 10 µg AgNPL-1. Por último, los transportadores en las membranas ABC de las células de las branquias se vieron inhibidos en el caso de la menor concentración de AgNP.Los resultados obtenidos durante el desarrollo de esta tesis permitieron obtener una visión amplia e integradora de los efectos tóxicos que provocan concentraciones subletales y ambientalmente relevantes de AgNP. Las nanopartículas metálicas fueron capaces de ser capturadas por las células de los organismos y bioacumularse, independientemente del organismo test (peces o moluscos) y el medio de dispersión (agua dulce o agua de mar). También se comprobó, en el caso de los peces, que son capaces de afectar la composición del mucus, convirtiéndose en una amenaza para las comunidades de bacterias benéficas que viven sobre la superficie del organismo. Por otro lado, el mecanismo principal que explica los efectos tóxicos fue el estrés oxidativo, ya sea por la inducción o inhibición de las enzimas antioxidantes, agotamiento del glutatión, u ocurrencia de daño oxidativo en lípidos. El hígado de los peces, y la glándula digestiva en los moluscos fueron los órganos blanco de las AgNP. Por su parte, también las branquias de los peces resultaron un tejido clave para evaluar los efectos tóxicos en donde se evidenciaron tanto respuestas de defensa (proliferación de células de mucus) como daños a nivel estructural (histopatologías, transaminasas). Dado que la producción, uso y liberación creciente de AgNP son una amenaza real y emergente en los ecosistemas de agua dulce y marinos, la información generada en esta tesis representa un valioso aporte para propósitos de regulación y control ambiental.

The growing production and use of silver nanoparticles (AgNP) due to their efficient biocides properties, inevitably lead to the release to environments in unknown amounts, where the aquatic systems always constitute the final sinks. The main objective of the present study was to investigate the toxicity mechanisms of AgNP in aquatic organisms. For this purpose, in vivo and ex vivo (gills) assays were carried out with freshwater fish and marine mussels. Low and environmentally relevant AgNP concentrations were selected from a commercial stock of colloidal nanosilver (Nanotek S.A., nanArgen®). The first assay was carried out with the in vivo exposure of Porchilodus lineatus (sábalo) juveniles to: 0 (control); 2.5 and 25 µg AgNP L-1 (renewals each 48 h) for 5 and 15 days. Total Ag accumulation increased after both concentrations and times of exposure according to the following sequence: liver>gills>intestine>brain. The hepatosomatic index augmented after both times of exposures to 25 µg AgNP L-1 . Regarding the hematology, after 5 days the red blood cells, the mean cell hemoglobin concentration, and the monocytes amount increased; meanwhile after 15 days of exposure, the amount of white blood cells and monocytes increased, and the mean cell hemoglobin and the lymphocytes amount decreased. In the mucus at the surface layer of fish exposed to both AgNP concentrations for 15 days, a decrease of bacteria colony forming units was observed. With respect to oxidative stress biomarkers, in the liver of fish an induction of all antioxidant enzymes was evidenced (superoxide dismutase, catalase -CAT-, glutathione S-transferase -GST-, glutathione reductase and glutathione peroxidase), and a decrease of ACAP levels after 15 days. On the contrary, in the gills of fish an inhibition of all antioxidant enzymes was observed in the case of the exposure to 25 µg AgNP L-1 for 5 days, and also after 15 days, lipid peroxidation (LPO) occurred. Moreover, after the exposure to the highest AgNP concentration changed the energetic reserves: plasmatic glucose and proteins (Prot) augmented after 5 days, and the hepatic and muscular glycogen and the muscular Prot increased after 15 days of exposure. On the other hand, the histological analysis in the gills of fish revealed a major amount of histopathologies and a mucus cells proliferation after 15 of exposure to 25 µg AgNP L-1 . Those results, in addition to the altered values of transaminases activities, evidenced serious damage in this vital organ. Lastly, a multivariate analysis was performed in order to obtain a holistic view of the results, and it clearly separated and showed a different physiologic profile in the case of fish exposed to 25 µg AgNP L-1 for 15 days. Besides, it ordered the individuals according to the different times of exposure. Secondly, an ex vivo assay was performed with gills of juveniles of Piaractus mesopotamicus (pacú) and adults of Corydoras paleatus (quitasueños) fish in order to expose the organ (using a saline solution as media) to AgNP and AgNO3. The toxic effects were analyzed through oxidative stress biomarkers, and also potential mitigations were evaluated when humic acids (HA) were present in the media. The treatments were: saline solution (control); saline solution + 10 mg HA L -1 (HA control); 100 µg AgNP L-1 ; 100 µg AgNP L-1 + 10 mg HA L -1 ; 100 µg AgNO3 L -1 ; 100 µg AgNO3 L -1 + 10 mg HA L -1 . After 1 h of exposure, in the gills of P. mesopotamicus the CAT activity increased in the case of AgNP and silver salt exposures. From their part, in the gills of C. paleatus the glutathione levels and GST activity were decreased in the case of the AgNO3 exposure, and also an increase of LPO levels was observed after the AgNP exposure. All effects were mitigated when the HA were present in the media. Lastly, an in vivo assay was carried out with the marine mussel Mytilus galloprovincialis as test organism, which was exposed to: 0 (control), 1 µg AgNP L-1 and 10 µg AgNP L-1 (renewals each 24 h) with natural seawater (NSW) for 96 h. The results showed an increase in Ag accumulation in the soft tissue of the bivalve. The hemocytes revealed a decreased of the lysosomal stability after both AgNP exposures, and also an increase of micronucleus frequency was observed. In the digestive gland of mussels, the GST activity augmented and also the LPO levels. The metallothionein induction was observed in the case of the 10 µg AgNP L -1 -exposure. The efflux activity mediated by the ABC transporters was inhibited in the gills of the mussels exposed to the lowest AgNP concentration. The obtained results through the development of this thesis allowed the achievement of an integral and wide overview of the toxic effects generated by sublethal and environmentally relevant AgNP concentrations. The metallic nanoparticles were captured and bioaccumulated by organism’s cells, independently of the test organism (fish of mussel) and dispersive media (freshwater or seawater). Moreover, in the case of fish, it was corroborated that AgNP altered the mucus composition and become a threat for the beneficial bacteria communities living on the organism surface. On the other way, the main toxicity mechanism that explained the toxic effects was the oxidative stress; because of the induction or inhibition of the antioxidant enzyme defense system, glutathione depletion, or oxidative damage occurrence. The liver of fish and the digestive gland of mussels were the target organs with respect to the AgNP. From their part, the gills of fish were also a key tissue for evaluating toxic effects; defense responses (mucus cells proliferation) and structural damage (histopathologies and transaminases activities) were evidenced. Due to the increasing production, use, and release of AgNP, these particles are an actual threat to freshwater and marine environments, and all information generated through this thesis represents an important contribution regarding regulation and environmental control purposes.