Echinococcus granulosus sensu lato en argentina: obtención de mapa epidemiológico y desarrollo de un sistema de diagnóstico molecular aplicable en programas de control de la hidatidosis

Abstract

La equinococcosis quística (EQ) es una enfermedad desatendida que afecta al ganado y humanos, especialmente a poblaciones de áreas remotas con economías y servicios de salud frágiles. El agente causante es el parásito cestode Echinococcus granulosus sensu lato (s. l.) compuesto por cinco especies y ocho genotipos: E. granulosus sensu stricto (G1 y G3), E. equinus (G4), E. ortleppi (G5), E. canadensis (G6, G7, G8 y G10) y E. felidis. Estas especies/genotipos difieren en la especificidad de hospedador, patogenicidad, antigenicidad, períodos pre-patentes, entre otras características. En Argentina circulan tres especies: E. granulosus s.s. (G1 y G3), E. ortleppi (G5) y E. canadensis (G6 y G7). El objetivo de la presente tesis fue elaborar un mapa epidemiológico de los genotipos/especies circulantes de E. granulosus s. l. en Argentina y desarrollar dos técnicas de copro-LAMP (Loop-Mediated Isothermal Amplification) para ser aplicados en estudios de epidemiología molecular y diagnóstico en hospedador definitivo.En el presente trabajo de tesis se analizaron por amplificación en cadena de la polimerasa (PCR) de una región del gen mitocondrial cox 1, con posterior secuenciación y alineamiento con secuencias cox1 de referencia de especies/genotipos de E. granulosus s. l., 98 muestras provenientes de diferentes hospedadores y zonas geográficas de la Argentina, informándose por primera vez la presencia de la especie E. canadensis (G6) en humanos provenientes de San Juan, San Luis y Salta; y E. ortleppi (G5) en la provincia de San Juan, además, se ampliaron los datos para las provincias de Buenos Aires, Córdoba, Chubut, Río Negro, Catamarca y Santa Fe, donde el número de casos analizados era escaso. Se optimizó la extracción de ADN de protoescólices, capa germinal, adultos, heces y esputo para análisis moleculares. Para el análisis de las muestras, se implementaron caminos alternativos a la secuenciación de productos PCR para ser implementados en estudios de epidemiología molecular. Se realizó la validación de ensayos de digestión de dichos productos por la enzima AluI, con el objetivo de diferenciar a la especie E. granulosus s. s. del resto de especies, y se utilizó el análisis de curvas de alta resolución de fusión (HRM, por su término en inglés: High Resolution Melting) para la identificación y diferenciación entre las especies E. granulosus s. s., E. ortleppi, y E. canadensis. Respecto al diagnóstico en el hospedador definitivo en el presente trabajo se pusieron a punto y diseñaron dos sets de primers LAMP, el primero consta de tres sub-sets de primers para la identificación de las especies E. granulosus s.s., E. ortleppi y E. canadensis, por separado, el cual fue puesto a punto para la identificación de especies a partir de heces, con el objetivo de ser empleados en estudios de epidemiología molecular. Por último, se diseñó y puso a punto un set de primers LAMP capaz de detectar las tres especies circulantes en Argentina de forma simultánea en una sola reacción, con el objetivo de ser propuestos como una nueva herramienta alternativa para el diagnóstico. Los resultados obtenidos ampliaron los conocimientos sobre la epidemiología molecular de E. granulosus s. l. en Argentina, los cuales son útiles teniendo en cuenta las diferencias existentes entre las especies que conforman el complejo. Por último, se puso a punto un sistema de diagnóstico basado en LAMP con valores de sensibilidad analítica de entre 10 fg y 100 fg de ADN, lográndose reacción positiva a partir de ADN extraído de heces caninas a las que se agegó un solo parásito adulto. La reacción permitió detectar ADN de las especies de E. granulosus s. l. circulantes en nuestro país y resultó específica, dado que no se obtuvieron productos LAMP con ADN de perro, Dipylidium caninum, Toxocara canis, Toxocara cati, Toxascaris leonina, Ancylostoma caninum, Taenia hydatigena y Tenia crassiceps. Este sistema diagnóstico podría ser implementado en zonas endémicas con bajos recursos y equipamientos. Ambos resultados contribuyen de forma activa al conocimiento básico y aplicado de la EQ en la República Argentina.

Cystic equinococcosis (CE) is a neglected disease that affects livestock and humans, especially in poor geographic areas with fragile economic and health services. The etiologic agent is Echinococcus granulosus sensu lato (s. l.) complex that is compost by five species and eight genotypes: E. granulosus sensu stricto (G1 y G3) E. equinus (G4), E. ortleppi (G5), E. canadensis (G6, G7, G8 y G10) y E. felidis. These species/genotypes are able to differ on host specificity, pathogenicity, antigenicity, pre-patent periods, among others. In Argentina, tree species were reported E. granulosus s.s. (G1 y G3), E. ortleppi (G5) y E. canadensis (G6 y G7). The aim of this thesis was to develop an epidemiological map of species/genotypes of E. granulosus s. l. circulating in Argentina and implementation of two copro-LAMP (Loop-Mediated Isothermal Amplification) reactions for its application in molecular studies and definitive host diagnoses. In these work ninety eight samples from different hosts from different areas from Argentina, were analyzed by polymerase chain reaction (PCR) of a mitochondrial cox 1 gene fragment, which were sequencing and alignment with references sequences of species/genotypes de E. granulosus s. l. The first time presence of E. canadensis (G6) in humans from San Juan, San Luis and Salta provinces, and E. ortleppi (G5) in San Juan province was reported. In the same way, low molecular epidemiology dates of Buenos Aires, Córdoba, Chubut, Rio Negro, Catamarca y Santa Fe provinces, were amplified. DNA extractions from protoscoleces, germinal layer, adult worms, canine feces, and sputum were optimized. Alternative techniques to sequencing of PCR products for molecular epidemiology studies were applied. The validation of Alu I digestion of amplification products to differentiation of E. granulosus s. s. species and analysis of high resolution melting curves (HRM) to differentiation of E. granulosus s. s., E. ortleppi, y E. canadensis species, were performed. In the present work, validation of LAMP to differentiated detection of E. granulosus s. s., E. ortleppi y E. canadensis for molecular studies from canine feces, was performed. Ultimately, a single LAMP reaction able to simultaneous detection of E. granulosus s. s., E. ortleppi y E. canadensis for canine diagnose, was developed and validated. The results obtained were useful to expand knowledge of molecular epidemiology of E. granulosus s. l. in Argentina. Alternative diagnose system to simultaneous detection of E. granulosus s. s., E. ortleppi y E. canadensis from canine feces was developed, which shows analytical sensitivity values of 10 fg and 100 fg of genomic DNA and showed positive reactions from feces spiked with one adult worm. The LAMP reaction was able to detect genomic DNA from of E. granulosus s. s., E. ortleppi y E. canadensis and it did not show cross reaction with genomic DNA from Canis lupus familiaris, Escherichia coli, Dipylidium caninum, Toxocara canis, Toxocara cati, Toxascaris leonina, Ancylostoma caninum, Taenia hydatigena, y Tenia crassiceps. This diagnostic system could be implemented in endemic areas with low resources and equipment. Both results, molecular epidemiology and copro-LAMP to canine diagnose, contribute actively to the basic and applied knowledge of CE in Argentina.