Caracterización de pepsina de sábalo (Prochilodus lineatus): Evaluación de su potencial aplicación industrial

Abstract

En la actualidad, se fabrican más de 500 productos industriales utilizando enzimas. Se las emplean de forma rutinaria en múltiples áreas: alimentos, piensos, detergentes, curtido, textiles, lavandería, productos farmacéuticos, cosméticos y química. Las proteasas representan uno de los tres grupos más grandes de enzimas utilizadas en la industria y se proyecta que su mercado global alcanzará US$ 2.210 millones en 2021. La pepsina es una proteasa aspártica y la principal enzima digestiva en el estómago de los animales. Se segrega como pepsinógeno (PG) en las células principales de las glándulas oxínticas ubicadas en el epitelio de la pared estomacal. Es utilizada ampliamente en la industria alimenticia como agente coagulante en la fabricación de quesos, elaboración de batidos e hidrolizados proteicos, cereales precocidos y bebidas saborizantes. También, se la aplica en las curtiembres para eliminar el vello y tejido residual del cuero, en la recuperación de plata de películas fotográficas, para la hidrólisis de IgG (obtención de fragmentos F(ab´)2) y como agente terapéutico en la regulación de la digestión, entre otros usos. Las pepsinas comercializadas y utilizadas en la industria son de origen porcino, vacuno y microbiano, sin embargo, las enzimas aisladas de las vísceras de peces se pueden utilizar para un gran número de aplicaciones en tecnológicas, aprovechando su comportamiento diferencial respecto a las fuentes mencionadas. En 2016 el consumo global de pescado ascendió a los 151 millones de toneladas. La producción mundial pesquera está conformada por los productos de captura (57%) y la acuicultura (47%). En Argentina la producción acuícola destinada al consumo humano ha mostrado un crecimiento lento, aunque sostenido, durante los últimos 20 años. Actualmente, el Nordeste Argentino cuenta con especies nativas cultivadas en menor o mayor alcance de producción, como el pacú, bagre, sábalo y el dorado. El sábalo (Prochilodus lineatus) representa el 50-90% de la biomasa total de peces en la cuenca del río Paraná (1000 kg/ha), constituye el 75-85% de las capturas de las pesquerías artesanales y en 2016 su exportación alcanzó las 7.190,86 toneladas. Dependiendo del tratamiento industrial que reciba, entre el 20 al 60% del peso del pescado capturado y comercializado se transforma en residuo. Entre las partes desechadas se encuentran las vísceras, la piel, escamas, huesos. Una estrategia interesante para la reducción de estos residuos es utilizarlos como fuente de subproductos comercializables. La mayoría de los subproductos derivados de la pesca y su industrialización se utilizan en la producción de aceite de pescado y harina de pescado. Sin embargo, estos podrían utilizarse para generar productos de mayor valor agregado. Estudios recientes han identificado una serie de compuestos de interés comercial presentes en los residuos y subproductos de las pescaderías. Los minerales, lípidos, aminoácidos, polisacáridos, proteínas y enzimas de animales acuáticos tienen características únicas y, sorprendentemente, su mayor concentración se encuentra a menudo en partes de los organismos que comúnmente se descartan. Por esta razón, el objetivo del presente trabajo de tesis fue valorizar la pesca y la piscicultura del sábalo en la región a través de la recuperación de proteasas digestivas, de alta aplicabilidad industrial, a partir de vísceras de desecho.En este trabajo de tesis se obtuvo con éxito un extracto crudo (EC) de mucosa gástrica de sábalo (Prochilodus lineatus) en medio ácido, con actividad proteolítica sobre solución ácida de hemoglobina como sustrato. El extracto crudo (EC) se sometió a un proceso de baja complejidad como es la precipitación salina, rindiendo un extracto enzimático (EE) con una actividad específica que duplica en valor la del EC. Se caracterizaron bioquímicamente los extractos (EC y EE) y se evaluó la actividad catalítica de los mismos sobre diferentes sustratos, atendiendo la posibilidad de un potencial uso industrial, comparándolos con pepsina porcina (PP).Al estudiar el efecto del pH sobre la actividad proteolítica se observó que los extractos EC y EE de sábalo presentaron máxima actividad catalítica a pH 2, lo cual concuerda con lo reportado para extractos gástricos con actividad pepsina de otros peces. Si bien los valores óptimos de pH para EC y EE coincidieron con los de la pepsina porcina (PP) comercial, se observó una diferencia significativa en la actividad proteolítica a valores de pH próximos al óptimo. Los extractos de sábalo mantuvieron una máxima actividad enzimática en un rango de pH de 2 a 4, conservando más del 80% de la actividad proteolítica máxima, mientras que la pepsina porcina exhibió su mayor actividad entre los pHs 1 y 2 para luego disminuir a valores por debajo del 40%. Esta particularidad también se ha reportado en pepsinas provenientes de peces de otras especies. Este comportamiento diferencial resulta relevante al momento de la utilización de estas enzimas en procesos industriales que requieren de pepsinas activas a pH no tan ácidos, como es la obtención de colágeno, que se efectúa a un pH próximo a 3.Se evaluó de la influencia de la temperatura sobre la actividad y se observó que la temperatura óptima de los extractos, la cual fue de 45°C. Este resultado está en concordancia con los óptimos determinados para los extractos de lenguado y rodaballo. El rango óptimo de temperatura para las pepsinas de peces se encuentra entre los 30 y 55ºC, las enzimas de cada organismo tienen características térmicas únicas, con la particularidad de que los que habitan en aguas frías poseen temperaturas óptimas menores que aquellos que habitan en aguas cálidas. Este comportamiento diferencial frente a la temperatura es lo que promueve el atractivo industrial de las enzimas de organismos acuáticos, convirtiéndolas en deseables para procesos que requieran bajas temperaturas, especialmente en la industria alimenticia. Las desventajas del uso de enzimas termoestables en procesos alimenticios a altas temperaturas incluyen un alto costo de energía, destrucción de sabores y nutrientes lábiles al calor, alteración en la integridad física del producto y un aumento relativo en reacciones secundarias indeseables.En este trabajo de tesis se determinó el efecto de elevadas concentraciones de NaCl sobre la actividad proteolítica para establecer la factibilidad de emplearlas como aditivos para acelerar la fermentación en productos con alto contenido de sales (e.g. salsa de pescado). Al evaluar la actividad de los extractos gástricos de sábalo y la pepsina porcina en un rango 0-30% NaCl, se observó que la actividad de las muestras decrecía de modo inversamente proporcional al aumento de la concentración de la sal, llegando a un mínimo de 9% y 15% de la actividad inicial, respectivamente. La disminución de la actividad podría deberse a la desnaturalización de las enzimas causada por el efecto de "salting out" provocado por el aumento de la concentración de NaCl. Los resultados obtenidos en esta tesis descartan la posibilidad de utilizar los extractos gástricos de sábalo como aditivos en procesos que involucren elevados contenidos de sal. Se estudió la influencia de iones divalentes en la actividad proteolítica de EC, EE y PP. Pues, la presencia de iones metálicos en el sitio activo puede ser crucial para la actividad de una enzima, aunque, en el caso de la pepsina esta dependencia no ha sido demostrada. La relación entre la activación de cationes metálicos sobre pepsinas provenientes de peces ha sido estudiada principalmente para los cationes Ca+2, Cu+2, Mg+2 y Co+2 con resultados dispares dependiendo de la especie de la cual provenga la enzima, éstos pueden estimular levemente la actividad o intensificarla La presencia de los cationes divalentes Ca+2 y Mg+2 (1 y 5 mM) tuvieron un leve sobre la actividad de los extractos de sábalo y la pepsina porcina, logrando incrementar aproximadamente el 10% la actividad proteolítica. Así, se constató un símil comportamiento entre las pepsinas de peces y la porcina en presencia de iones metálicos. Se observa la activación, aunque leve, de la actividad enzimática en presencia cationes, la cual incrementa conforme lo hace la concentración de los mismos en el medio de reacción.El uso de inhibidores específicos sobre extractos enzimáticos obtenidos de tejidos proporciona datos valiosos sobre la naturaleza da las enzimas se encuentran actuando en los mismo. En este trabajo se evaluaron los efectos de la Pepstatina A, el EDTA y el PMSF. La pepstatina A, un pentapéptido aislado del cultivo de Streptomyces spp, es un inhibidor específico de proteasas aspárticas que inhibe la actividad de la pepsina, la catepsina D y la renina. Al incubar 10µM pepstatina A con las muestras, se observó la inhibición del 96, 97 y 100% de la actividad enzimática de EC, EE y PP, respectivamente. Este comportamiento coincide con lo observado para otras pepsinas y proteasas de peces, las cuales en presencia de pepstatina A disminuyen su actividad proteolítica en proporciones iguales o mayores al 97% (respecto a la actividad control).El EDTA (agente quelante de iones metálicos) y el PMSF (nhibidor de serino proteasas) no tienen efectos inhibitorios en la actividad proteolítica de las pepsinas aisladas de peces. Al estudiar el efecto de estos inhibidores sobre los extractos enzimáticos de sábalo se encontró que el PMSF (1mM) no afectó la actividad proteolítica, en cambio el EDTA (2mM) disminuyó la actividad de los EC y EE en el orden de 24 y 22%, respectivamente.Teniendo en cuenta los resultados hasta aquí analizados, es posible que las proteasas activas de los extractos de sábalo sean del tipo ?pepsin-like?, ya que son efectivamente inhibidas por la pepstatina, y que la actividad de estas sea incrementada por la presencia de cationes divalentes, como lo indican los datos de actividad enzimática obtenidos en presencia de Ca+2, Mg+2 y EDTA.En este trabajo también se determinó la influencia del SDS (dodecilsulfato de sodio, un detergente iónico ampliamente utilizado en la industria y los laboratorios) en la actividad enzimática de los extractos y la pepsina porcina. Se ensayó el efecto del SDS a 0.05-0.10% (P/V) y se observó un efecto inhibitorio parcial sobre los extractos de sábalo y la pepsina porcina. La actividad del extracto crudo y el enzimático disminuyeron hasta el 60,3 y el 56,4 % después de incubarse con 0,1% de SDS. La reducción de la actividad en presencia de SDS ha sido descripta para varias enzimas y se lo atribuye a la alteración de sus estructuras como consecuencia de la interacción con el SDS. El pH y la temperatura son dos factores físicos que pueden alterar la estabilidad de una enzima, por ello sus efectos sobre EC y EE se estudiaron en este trabajo de tesis.Luego de incubar los extractos de sábalo a diferentes pH (2h), éstos presentaron una actividad residual ≥90% de su máximo pHs comprendidos entre 1 -5, y demostraron ser moderadamente estables en condiciones neutras y levemente alcalinas. Al ser pre-incubados a pH 7 y 8 los extractos retuvieron más del 70% y 25% de su actividad inicial, mientras que la pepsina porcina resultó inactivada a pH mayores a 7. Este comportamiento se condice con lo esperado pues el sábalo es un pez de aguas cálidas. Las diferencias entre la estabilidad de los extractos y la pepsina porcina a pH neutros y levemente alcalinos puede ser una ventaja para aquellos procesos que requieran llevarse a cabo a pH no-extremadamente ácidosLas pepsinas provenientes de organismos acuáticos se caracterizan por ser estables a temperaturas por debajo de los 40-55°C, mientras que la pepsina porcina es estable hasta los 60°C. Algunos autores sostienen que las diferencias se encuentran en el número potencial de enlaces disulfuro, la hidrofobicidad promedio y la cantidad de enlaces de hidrógeno intramoleculares afectan la termoestabilidad de las enzimas de diferentes especies. En concordancia, se observó que los extractos de sábalo fueron estables hasta los 37°C, mientras que la pepsina porcina lo fue hasta los 60°C. Esta diferencia de estabilidades a temperaturas moderadas (37-60°C) representan una ventaja energética en los procesos para inactivar las enzimas sin comprometer la integridad de los productos y disminuyendo los costos de servicios auxiliares. Al estudiar la estabilidad de los extractos de sábalo y la pepsina porcina durante 8h, se pudo observar que todas las muestras conservaron su máxima actividad catalítica a las temperaturas de 4 y 37°C. Sin embargo, a 60ºC la estabilidad térmica de la pepsina porcina fue notoriamente mayor a la observada para los extractos de sábalo, después de las 2h de incubación los extractos perdieron más del 85% de su actividad proteolítica.Esto refuerza la perspectiva señalada en el punto anterior, posicionando estos extractos como una alternativa para efectuar procesos de hidrólisis a temperaturas moderadas y con posibilidad de detenerlos con shocks térmicos a temperaturas relativamente bajas, entre 60 y 70°C. En los procesos industriales gran parte de las operaciones de calefacción se efectúan utilizando vapor. Los datos provenientes de la industria indican que el promedio del uso de energía proveniente del vapor industrial podría llegar a alcanzar entre el 35 y el 40 % de uso energético de las instalaciones. Por lo tanto, es muy importante optimizar procesos que minimicen las operaciones de calefacción, minimizando los costos operativos y de producción.Para evaluar la actividad catalítica del EC y EE sobre diferentes sustratos, atendiendo la posibilidad de un potencial uso industrial, se ensayaron: recuperación de placas radiográficas, actividad coagulante de la leche, hidrólisis de colágeno, hidrólisis de inmunoglobulinas y obtención de colágeno de la piel de sábalo.Las placas radiográficas son hojas de poliéster recubiertas por una matriz de gelatina impregnada con haluro de plata y que contiene una concentración de Ag en el rango del 14-17%. En consecuencia, es posible llevar a cabo procesos de recuperación de plata metálica basados en métodos enzimáticos utilizando proteasas que degraden la matriz que contiene la plata metálica, permitiendo también la recuperación de la placa de poliéster. Hasta el momento, en la bibliografía publicada, las proteasas utilizadas son del tipo alcalinas y obtenidas principalmente de bacterias y hongos y se ha encontrado sólo una publicación que emplea extractos alcalinos provenientes de las vísceras de pez Labeo rohita. En este trabajo, al emplear proteasas ácidas con actividad pepsina, del sábalo y pepsina porcina comercial se encontró que el extracto enzimático logró hidrolizar completamente la capa que cubre la placa radiográfica, la cual contiene gelatina, luego de 46h a 40°C. Sin embargo, tanto la pepsina porcina como el extracto crudo ácido no lograron la degradación total del recubrimiento de gelatina en las condiciones evaluadas. Los tratamientos con proteasas alcalinas de bacterias y hongos han logrado recuperar la plata con tratamientos de tiempos más cortos a temperaturas levemente superiores e iguales. Esto demuestra que las proteasas alcalinas son más eficientes que las proteasas ácidas para efectuar la hidrólisis de la gelatina, sin embargo, es factible el emplear el extracto enzimático de sábalo para la recuperación de la placa de polietileno y la plata presentes en las de placas fotográficas. La nobleza que presenta esta alternativa es la baja tecnificación del proceso, ser amigable con el medio ambiente pues no genera residuos tan contaminantes como los procesos tradicionales de recuperación y que es una metodología de recuperación basado en utilizar proteasas obtenidas de residuos.En la producción de queso la coagulación de la leche se puede inducir por acción enzimática, además del cuajo de ternero (extracto 1:9 de pepsina: quimosina), se pueden utilizar enzimas de fuentes animales, vegetales, microbianas o de microorganismos genéticamente modificados. Para que una enzima sea susceptible a ser utilizada en la elaboración de quesos no sólo debe ser capaz de inducir la coagulación (hidrolizando el enlace Phe105-Met106 de la k-caseína), sino que también debe provocar una baja proteólisis inespecífica, para evitar la reducción del rendimiento y la aparición de defectos en sabor y textura del producto final. Si bien la pepsina porcina presenta actividad coagulante de leche y su actividad proteolítica inespecífica hidroliza los enlaces con los residuos de Phe, Tyr, Leu o Val, favoreciendo la formación de péptidos indeseables, las pepsinas aisladas de peces han sido investigada extensamente como una posible enzima para la producción de quesos. Al evaluar la capacidad coagulante de los extractos de sábalo (EC y EE) y la pepsina porcina se observó que los mismo poseían una fuerza del cuajo (RS) 6,7 ± 0,13; 8,0 ± 0,02 y 625,1 ± 9,8, respectivamente. En base a estos resultados, los extractos de sábalo no serían agentes coagulantes aptos para la producción de quesos, dado su baja eficiencia para la coagulación de la leche. Los hidrolizados de colágeno son de naturaleza bioactiva, exhiben numerosas propiedades y características atractivas para su uso en la industria farmacéutica, alimentaria y cosmética, En general la pepsina presenta una menor capacidad de hidrólisis del colágeno frente a otras proteasas, por lo que no resulta eficiente para generar péptidos bioactivos, sin embargo, los hidrolizados que se obtiene con ella poseen capacidades emulsionantes y gelificantes. Puntualmente, pepsinas de peces no han sido ensayadas previamente sobre esta propiedad. En este trabajo de tesis se realizó un ensayo similar, comprobándose la capacidad por parte del EC y EE de sábalo de degradar las cadenas del colágeno tipo I de ratón. Estos resultados abren un nuevo panorama de posibles usos para las pepsinas de peces en la producción de hidrolizados de colágeno.La pepsina es la única enzima capaz de escindir completamente la IgG para dar F(ab?)2 y, por lo tanto, la mayoría de los productos terapéuticos basados en anticuerpos consisten en estos fragmentos preparados por digestión con pepsina porcina. No se han encontrado en la bibliografía trabajos referentes al uso de proteasas de peces para la obtención de fragmentos F(ab?)2 a partir de IgG purificada o suero de alguna especie. En el presente trabajo de tesis, se constató que la acción de los extractos de sábalo sobre un pool de IgG de suero equino produjo una degradación parcial de las inmunoglobulinas, aun exponiendo la reacción durante un lapso de 48 h. Se refleja una cinética de hidrólisis lenta comparada con la acción de otras pepsinas. Esto puede atribuirse a la mayor actividad y concentración de las enzimas utilizadas, el pH final de la mezcla de reacción (∿3,5-4), también podría deberse a la poca afinidad del extracto de sábalo por este sustrato de origen equino. En este sentido los resultados obtenidos permiten explorar nuevas experiencias para verificar si el extracto pepsinico de sábalo tiene mayor actividad sobre IgG provenientes de otras especies, para la producción de fragmentos F(ab?)2.En los últimos 15 años se han publicado varios artículos referentes a la extracción y el estudio del colágeno obtenido de peces, no sólo empleando como material de partida la piel, sino también las escamas y las vejigas natatorias. Tradicionalmente, el colágeno se extrae utilizando una solución ácida (principalmente ácido acético 0,5M) sin adición de enzimas. Sin embargo, se ha observado que el colágeno presente en subproductos de peces (piel, cartílagos, etc) no se disuelve en solución de ácido acético. Por ello se desarrolló un proceso de extracción enzimática para maximizar su rendimiento y a tal fin se han empleado diversas enzimas (tripsina, pepsina y colagenasa). En este trabajo de tesis se evaluó la piel de sábalo como fuente de colágeno en simultáneo con el estudio de la capacidad de sus extractos enzimáticos para solubilizarlo durante la extracción. El análisis de la composición de la piel reveló que la misma presenta el 52,5% de humedad; 5,5% de ceniza, 12,82% de proteína y 28,12% de grasa (en base húmeda) y 3,5mg de hidroxiprolina por gramo de piel. A partir del contenido de hidroxiprolina, se estimó el contenido de colágeno. Este aminoácido es un producto postraduccional de la hidroxilación de la prolina. Debido a su distribución restringida y única en el colágeno de tejido conectivo, se puede estimar el contenido de colágeno midiendo el contenido de Hyp, considerándose que el 12.5% del colágeno es Hyp. Conforme a los resultados obtenidos, 100 gramos de piel de sábalo contienen ~ 350 mg de Hyp, por ende, 2,8 g de colágeno. Esta proteína con función estructural representa el 21,8 % de las proteínas totales de la piel de sábalo.La obtención del colágeno de la piel de sábalo se efectuó a partir de las siguientes extracciones: ácida -como control- (ASC), ácida con agregado de pepsina porcina (PSC)y ácida con agregado de extracto crudo (ECSC) y extracto enzimático (EESC). La adición de extracto crudo (ECSC) y extracto enzimático (EESC) de sábalo incrementó la extracción de colágeno sólo con ácido, 1,2 y 1,7 veces, respectivamente. La enzima, también ejerció el mismo efecto, comparable en magnitud al ejercido por EC. Resultados similares fueron publicados por otros autores al adicionar pepsina porcina y EC de peces con actividad pepsina al proceso de obtención de colágeno de piel de peces, evidenciando que su acción enzimática incrementa la extracción.La piel y los huesos de los peces contienen colágeno tipo I como colágeno principal. El colágeno tipo I de la piel de peces puede presentar, también, componentes de alto peso molecular, como las cadenas β (dímeros de la cadena α) y γ. La movilidad electroforética de las muestras del colágeno del extraído de la piel del sábalo por los diferentes métodos (ASC, PSC, ECSC, EESC) mostró un patrón de bandas similar al esperado para el colágeno tipo I. Los componentes mayoritarios del colágeno fueron las cadenas α1, α2, y β, en menor proporción se observaron componentes de mayor peso molecular como las como cadenas γ.Considerando la relevancia económica del sábalo en el NEA y el hecho de que su procesamiento genere descartes que representan entre el 20 al 60% de su peso, resulta primordial evaluar alternativas para revalorizar estos desechos. La extracción de colágeno de la piel de sábalo empleando EC y EE resulta interesante como alternativa para revalorizar dichos desechos. Si bien se ha observado un bajo contenido de colágeno en la piel de este pez, la eficacia de los extractos para solubilizarlo indica que podrían ser utilizados como un aditivo de bajo costo para la obtención de este producto. Por otra parte, aunque el agregado de EE sea el que logra una mejor solubilización del colágeno, el EC sigue siendo una opción interesante ya que genera rendimientos equivalentes a la PP, siendo su obtención es más sencilla, y por ende, menos costosa. La extracción de colágeno de la piel de sábalo en estas condiciones conduce a una doble explotación de los descartes de pesquerías de este pez utilizando no solo las vísceras como fuente de proteasa, sino también la piel. En este trabajo de tesis sólo se ha explorado la obtención de colágeno de la piel, pero también se podría utilizar las escamas, los cartílagos, los huesos y las escamas del pez como fuentes de esta proteína o de su forma desnaturalizada, la gelatina. Considerando la relevancia económica del sábalo en el NEA y el hecho de que su procesamiento genere descartes que representan entre el 20 al 60% de su peso, resulta primordial evaluar alternativas para revalorizar estos desperdicios. La extracción de colágeno de la piel de sábalo empleando EC y EE resulta interesante como alternativa para revalorizar dichos desechos. Si bien se ha observado un bajo contenido de colágeno en la piel de este pez, la eficacia de los extractos para solubilizarlo indica que podrían ser utilizados como un aditivo de bajo costo para la obtención de este producto. Por otra parte, aunque el agregado de EE sea el que logra una mejor solubilización del colágeno, el EC sigue siendo una opción interesante ya que genera rendimientos equivalentes a la PP, siendo su obtención es más sencilla, y por ende, menos costosa. La extracción de colágeno de la piel de sábalo en estas condiciones conduce a una doble explotación de los descartes de pesquerías de este pez utilizando no solo las vísceras como fuente de proteasa, sino también la piel. En este trabajo de tesis sólo se ha explorado la obtención de colágeno de la piel, pero también se podría utilizar las escamas, los cartílagos, los huesos y las escamas del pez como fuentes de esta proteína o de su forma desnaturalizada, la gelatina. Desde 1940 se han aislado y caracterizado pepsinas de diversas especies de peces, tanto de ambientes marinos como de agua dulce, con especial auge en los últimos 20 años. En este trabajo de trabajo de tesis, el aislamiento se llevó a cabo a partir de un extracto que contenía la enzima en su forma activa. En consecuencia, se desarrolló un protocolo para trabajar a condiciones estables para el extracto, a partir de los resultados de actividad y estabilidad reportados en el apartado 4.2. Partiendo de un extracto crudo de la mucosa del sábalo y a través de los procedimientos de precipitación salina, cromatografía de exclusión molecular (Sephadex G-75) y cromatografía de intercambio iónico (DEAE-HiTrap FF), se aisló una enzima tipo pepsina del sábalo de 36kDa. Las masas moleculares de las pepsinas aisladas de peces se encuentran en el rango de 30 a 42 kDa, con pocas excepciones como ser la pepsina de Sardinella aurita de 17kDa. Al finalizar la purificación se logró la recuperación del 7,7% de la actividad proteolítica inicial, con un factor de purificación de 12,6. La proteasa aislada representó el 0,6 % (m/m) del contenido total de proteínas del EC. El hecho de haber requerido de 60 estómagos de sábalo (que representan una masa de 1,3 Kg de víscera inicial, 73 g de mucosa gástrica, que rinden 63 mg de proteína inicial) para obtener tan solo 0,38 mg de enzima, deja en evidencia que esta especie no sería de las más apropiadas como fuente de enzimas del tipo pepsina. No obstante, sus propiedades pueden volverla una víscera de interés. Para un mejor aprovechamiento de los microgramos disponibles de enzima, se estudió la influencia de las variables pH y temperatura sobre la actividad proteolítica de la pepsina aislada, en forma simultánea, seleccionando las condiciones de pH y temperatura a través del software Design expert 7. Así se pudo constatar que la pepsina se comporta de modo similar a los extractos que le dieron origen. Mostró sus mayores actividades a pHs menores a 4,5 y temperaturas en torno a 33°C, anulándose por encima de pH 8 (a cualquier temperatura). Por otro lado, la enzima también mostro inactividad a temperaturas por encima de 65°C. De la comparación con la pepsina porcina comercial, la pepsina de sábalo, como gran parte de las pepsinas de peces es vulnerable a las altas temperaturas. Este comportamiento diferencial es lo que vuelve atractivas a las enzimas de organismos acuáticos para su uso industrial, especialmente la alimenticia, que requiere de procesos donde la inactivación de las enzimas no exija de altas temperaturas y con ello evitar alto costo de energía, destrucción de sabores y nutrientes lábiles al calor, alteración en la integridad física del producto y un aumento relativo en reacciones secundarias indeseables. En base a lo expuesto se concluye que, tanto la pepsina aislada como los extractos, reúnen propiedades atractivas para su uso industrial, principalmente en la extracción de colágeno de la propia piel del sábalo.Este pescado, tan abundante en la cuenca del río Paraná, y , por ende con tal grado de capturas en la pesca artesanal, tiene un bajo nivel de pepsina, no obstante, la simplicidad de preparación del extracto rico en esta enzima vuelve de interés el aprovechamiento de su víscera.Teniendo en cuenta el impacto económico del sábalo en las pesquerías de América del Sur, el uso de su piel para la extracción de colágeno utilizando un extracto de enzimático estomacal del mismo pez es una opción atractiva para la región, a pesar del hecho de que la piel del sábalo tiene una baja cantidad de colágeno. Esta opción podría representar un doble beneficio: económico y ambiental, al generar valor agregado a un residuo cuya disposición final causa polución.