Capacidad xenohormética de fitoextractos y sus derivados frente a inmunotoxicidad por arsénico

Abstract

El arsénico (As) es un tóxico ambiental ampliamente diseminado en todo el mundo. Se encuentra como contaminante de alimentos y agua de bebida en numerosos países, entre ellos la República Argentina. Los órganos y tejidos que constituyen el sistema inmune son blancos de sus efectos deletéreos, por lo que los cambios que tienen lugar tras la exposición a As están relacionados con una respuesta inmunitaria afectada. En este sentido, se ha informado que Lantana grisebachii Stuck. (LG), Aspidosperma quebracho-blanco Schltdl. (AQB) e Ilex paraguariensis A. St.-Hil. (IP) presentan propiedades antiinflamatorias y antioxidantes, por lo que el objetivo de la presente tesis fue establecer la capacidad xenohormética de los extractos acuosos de dichas plantas y sus derivados frente a inmunotoxicidad inducida por As. Para ello, se ensayaron, en primera instancia, los efectos del consumo oral (100 mg de extracto seco/Kg/día durante 30 días) de los fitoextractos en ratones Balb/C (n≥3) de ambos sexos, mediante la determinación de los compuestos fenólicos aportados por éstos y su biodisponibilidad en los tejidos hemolinfáticos, el análisis de trofismo orgánico y parámetros de estrés oxidativo tales como peróxidos acuosos y lipídicos (HP y LP respectivamente), anión superóxido (SO) y nitritos en bazo, timo y sangre murinos. El análisis de los datos (ANAVA, p<0,05) confirmó a los tres extractos ensayados como fuentes de compuestos fenólicos (IP, LG y AQB en orden decreciente), aunque su biodisponibilidad en los tejidos hemolinfáticos estuvo condicionada por el sexo, presentando las hembras concentraciones mayores en general. En cuanto a la respuesta redox, el consumo de LG tuvo un efecto prooxidante a partir de una inducción desigual en la formación de especies reactivas de oxígeno (ERO) en machos y hembras. AQB, por su parte, redujo la peroxidación en sangre y bazo de ambos sexos, con regulación nitrosativa positiva en timo, aunque los efectos antioxidantes no dependieron de los fenoles. Por último, IP exhibió efectos disímiles según sexo, mostrando los machos ciertos efectos antioxidantes, mientras que las hembras fueron susceptibles a estrés oxidativo. Posteriormente, se eligieron los extractos identificados de uso seguro (AQB e IP) y se procedió a evaluar su potencial protector frente a As, en un modelo animal desarrollado a tal efecto. Así, los animales recibieron, por vía oral, 50-100 mg/Kg de extracto de AQB o IP, y 0 mg/Kg (control) y, luego de 3 horas, fueron inyectados intraperitonealmente con 100 µL de solución fisiológica (control) o 19 mg/Kg de NaAsO2 (DL50). Se obtuvieron, por cultivo primario de bazo, esplenocitos sobre los cuales se aplicó el ensayo de viabilidad celular de resazurina, observando un descenso significativo de este parámetro por exposición a As, el cual es recuperado por la administración oral previa de IP (50 mg/Kg). AQB, por su parte, resultó tóxico per se, además de no proteger a las células frente a As. Luego, se determinó la concentración tisular de compuestos fenólicos y hierro en los bazos, timos y sangre de los animales tratados con As, IP e IP + As (versus control), y se evaluaron marcadores oxidativos [HP y LP, productos avanzados de oxidación proteica (PAOP) y grupos sulfhidrilos libres (SH)] para establecer el efecto redox del NaAsO2, de IP (fitoextracto bioactivo) y el uso concomitante de ambos. El análisis de los resultados (ANAVA, p<0,05) mostró que la exposición a As disminuye la concentración de SH libres en esplenocitos y bazo y altera el contenido y distribución del hierro en bazo, pero no incrementa la producción de peróxidos en este órgano, por lo que la inducción de estrés oxidativo no sería la vía involucrada en la pérdida de viabilidad celular. IP, por su parte, incrementa los niveles de SH libres, recupera los valores dosados de hierro y genera niveles elevados de peróxidos, y consecuentemente de PAOP, por lo que el aumento de los compuestos fenólicos que se verifica con la ingesta de IP tendría un efecto prooxidante. Para establecer las vías metabólicas involucradas en los efectos descritos, se determinó la concentración de glucosa, lactato, anión superóxido (SO) y SH libres en los esplenocitos. Así, se determinó que la exposición a arsénico conlleva a una reducción en la función mitocondrial de los mismos que deriva en la muerte celular. Por otra parte, el tratamiento con IP incrementa la captación de glucosa por los esplenocitos, lo cual aumentaría el metabolismo aeróbico por sobre el anaeróbico, con la consecuente disminución de lactato intracelular y la acumulación de ERO. Este efecto, junto con la capacidad de IP de inducir la actividad del NF-κB, paralelamente determinada, condiciona una bioquímica celular diferente que responde manteniendo a la célula viable frente a la toxicidad del As.

Arsenic (As) is an environmental toxic widely distributed worldwide. It is found as a food and water pollutant in several countries, including Argentina. Organs and tissues that constitute the immune system are targets of its deleterious effects; thus, the changes that occur after exposure to As are related to an impaired immune response. In this sense, it has been reported that Lantana grisebachii Stuck. (LG), Aspidosperma quebracho-blanco Schltdl. (AQB) and Ilex paraguariensis A. St.-Hil. (IP) have antiinflammatory and antioxidant properties; thus, the aim of this thesis was to establish the xenohormetic capacity of the aqueous extracts of this plants and their derivatives, against arsenic-induced immunotoxicity. First, the effects of oral consumption (100 mg of dry extract/Kg/day for 30 days) of phytoextracts were tested in Balb/C mice (n≥3) of both sexes, by determining of phenolic compounds and their bioavailability in hemolymphatic tissues, analysis of organic trophism and oxidative stress parameters, such as aqueous and lipid peroxides (HP and LP respectively), superoxide anion (SO) and nitrites in murine spleen, thymus and blood. The data analysis (ANOVA, p<0,05) confirmed that the three extracts were sources of phenolic compounds (IP, LG and AQB in decreasing order), although their bioavailability in hemolymphatic tissues was conditioned by sex, with often higher concentrations in females. Regarding the redox response, LG consumption had a prooxidant effect with unequal induction of reactive oxygen species (ROS) production in males and females. On the other hand, AQB reduced peroxidation in blood and spleen of both sexes, with positive nitrosative regulation in thymus, although the antioxidant effects were not phenol-dependent. Finally, IP exhibited dissimilar effects according to sex, with some antioxidant effects in males, whereas females showed oxidative susceptibility.Subsequently, the safe extracts were chosen (AQB and IP) to be used as potential protective agents against As in an animal model developed for this purpose. Thus, mice received 50-100 mg/Kg of AQB or IP extract, and 0 mg/Kg (control group). After 3 hours, they were intraperitoneally injected with 100 μL of physiological solution (control group) or 19 mg/Kgof NaAsO2(LD50). Splenocytes were obtained by primary spleen culture to apply resazurin cell viability assay, verifying a significant decrease of this parameter by exposure to AMC14As, which is recovered by the previous oral administration of IP (50 mg/Kg). AQB did not protect cells against As and, in addition, was toxic by itself. Then, tissue concentration of phenolic compounds and iron in the spleens, thymuses and blood of the animals treated with As, IP and IP + As (versuscontrol group) was determined, and oxidative markers were evaluated [HP and LP, advanced products of protein oxidation (PAOP) and free sulfhydryl groups (SH)] to establish the redox effect of NaAsO2, IP (bioactive phytoextract) and both ones. The data analysis (ANOVA, p<0,05) showed that As exposure decreased the concentration of SH in splenocytes and spleen, altered the content and distribution of iron in spleen, but did not increase the production of peroxides in this organ. Therefore, induction of oxidative stress was not the mechanism involved in the observed cell death. Moreover, IP increased the levels of SH, recovered the levels of iron, but generated high levels of peroxides and consequent PAOP; thus, the verified increase of phenolic compounds after IP intake showed prooxidant effects. In order to establish the metabolic pathways involved in these effects, concentrations of glucose, lactate, superoxide anion (SO) y SH were determined in splenocytes. It was demonstrated that exposure to As caused reduction of mitochondrial function leading to cell death. On the other hand, IP treatment increased glucose uptake by splenocytes, which increased aerobic metabolism with respect to anaerobic metabolism, with the consequent decrease of intracellular lactate and accumulation of ROS. This effect, together the capacity of IP to induce NF-κB activity, conditioned a different cellular biochemistry, which kept cell viability against the toxicity of the As.