Estudio de las extensinas específicas de polen (LRXs) involucradas en el crecimiento polarizado de tubos polínicos en Arabidopsis thaliana

Abstract

El crecimiento celular polarizado de los tubos polínicos es un proceso oscilatorio que implica una compleja regulación de iones Ca2+, especies reactivas de oxígeno (EROs) y alto tráfico vesicular hacia la zona apical. Durante este proceso ocurre la constante remodelación de la pared celular, la cual debe ser rígida para soportar las presiones citoplasmáticas laterales de turgencia pero a la vez flexible en la zona apical para posibilitar el crecimiento. Para esto, es crucial que el ensamblado de la pared celular se encuentre estrictamente regulado mediante la construcción de una red flexible generada por el entrecruzamiento entre glicoproteínas específicas y homogalacturonanos presentes en el espacio apoplástico. En angiospermas, las glicoproteínas ricas en hidroxiprolina (HRGPs) constituyen una de las familias más abundantes de proteínas estructurales que mayor número de modificaciones post-traduccionales sufre. Miembros de esta familia son las extensinas (EXTs), los arabinogalactanos asociados a proteínas (AGPs) y las proteínas repetitivas en prolina (PRPs). Dentro de las EXTs, se encuentra la subfamilia de las proteínas LRXs (Leucine-rich repeat extensins) constituida por 11 miembros, de los cuales 4 (LRX8, LRX9, LRX10 y LRX11), se expresan específicamente en polen maduro y tubo polínico. Dichas proteínas, presentan una estructura modular formada por un dominio N-terminal rico en repeticiones de leucina (LRR) y un dominio C-terminal de tipo extensina plausible de ser glicosilado. En este trabajo de tesis, caracterizamos y estudiamos la función de las proteínas LRXs de polen (LRX8, LRX9, LRX10 y LRX11). Mediante ensayos fisiológicos se demostró que la ausencia de las proteínas LRX8-LRX11, afecta la germinación de los granos de polen, ocasiona alteraciones en la integridad de los tubos polínicos y provoca desviaciones en la herencia mendeliana. Así mismo, se observó mediante microscopía 5 confocal, que la mutante triple pérdida de función lrx9 lrx10 lrx11 presenta fallas en el ensamblado de la pared celular, tales como la deposición alterada de los polisacáridos más abundantes, calosa y pectina. Las evidencias obtenidas sugieren que las proteínas LRX8-LRX11 son necesarias para el mantenimiento de la integridad de la pared celular de los tubos polínicos durante el crecimiento celular polarizado. El motivo EXT presente en las HRGPs se caracteriza por poseer numerosas repeticiones de la secuencia Ser(Pro)3-5. Previo a ser secretadas a la pared celular, es necesario que ocurran tres modificaciones post-traduccionales (MPTs): la monogalactosilación de los residuos serina (Ser) (N-glicosilación), la hidroxilación de los residuos prolina (Pro) a hidroxiprolina (Hyp) y la posterior O-glicosilación de la Hyp. Las enzimas responsables de catalizar la hidroxilación de Pro son las prolil-4-hidroxilasas (P4Hs). Es por ello que estudiamos el rol de las proteínas P4H4 y P4H6, de alta expresión en polen, y la importancia de la hidroxilación de las HRGPs. Los resultados obtenidos mostraron que las mutantes simples p4h4, p4h6 y la mutante doble p4h4 p4h6, presentan una disminución en la tasa de germinación de los granos de polen. Resultados similares se obtuvieron al bloquear la acción de las enzimas P4Hs empleando los inhibidores químicos EDHB (etil-3,4-dihidroxibenzoato) y DP (α,α-dipiridil). Si bien se observó una reducción en el largo de los tubos polínicos de la mutante doble p4h4 p4h6, la disposición y el contenido de pectina en la pared celular de tubos polínicos mutantes fue similar al de plantas wild type. Finalmente, se determinó la posible localización subcelular de la enzima P4H4 en el retículo endoplasmático (RE)/aparato de Golgi en tubos polínicos de plantas transgénicas expresando la construcción pP4H4::P4H4-YFP. En base a lo observado, proponemos que la hidroxilación de las HRGPs, y posiblemente de las LRXs, sería catalizada por las P4Hs en el RE/aparato de Golgi y sería necesaria principalmente durante los primeros estadíos del desarrollo del tubo polínico. Sin embargo, se requerirán nuevos estudios para determinar si, además de P4H4 y P4H6, existe otra enzima de la familia P4H implicada en la hidroxilación de las HRGPs, particularmente las LRX de polen

In angiosperms, hydroxyproline-rich glycoproteins (HRGPs) are cell wall proteins which exhibit a high number of post-translational modifications (PTM). Members of this family are the extensins (EXTs), arabinogalactan-proteins (AGPs) and proline-rich proteins (PRPs). The LRXs (Leucine-rich repeat extensins), belong to the EXTs family; there are 11 members in Arabidopsis, 4 of which (LRX8, LRX9, LRX10 and LRX11) are highly express in mature pollen and pollen tubes. These chimeric proteins contain an N-terminal LRR (Leucine-rich repeat) domain followed by a Cys-rich domain and a C-terminal EXT-like domain. In this study, we demonstrated the involvement of pollen-specific LRXs proteins (LRX8, LRX9, LRX10, and LRX11) in cell wall assembly during polarized growth of pollen tubes. We observed by performing physiological assays, that the lack of LRX8-LRX11 affect the germination rate of pollen grains, the cell wall integrity of pollen tubes and alter mendelian inheritance. By using confocal microscopy, we observed that the triple mutant lrx9 lrx10 lrx11 exhibit altered deposition of callose and pectin at the cell wall. These results suggested that LRX8-LRX11 proteins are necessary to maintain pollen tube cell wall integrity during polarized growth. The EXT motif from HRGPs proteins is characterized by the presence of numerous repetitions of Ser(Pro)3-5 sequence. Before EXTs are secreted to the cell wall, several PTMs occurs over the Ser(Pro)3-5 motif: Ser monogalatosylation (N-glycosylation), hydroxylation of Pro to hydroxyproline (Hyp) and O-glycosylation of Hyp. The hydroxylation of Pro is exclusive from plants and is catalyzed by prolil-4-hydroxylases (P4Hs). According to that, we were focused in the functional study of P4H4 and P4H6 enzymes, highly expressed in pollen, and to explore the relevance of HRGPs hydroxylation. Our results showed a decrease in germination rates of p4h4 and p4h6 simple mutants and 7 p4h4 p4h6 double mutant pollen grains. Similar results were obtained by blocking P4Hs activity applying EDHB (ethyl 3,4-dihydroxybenzoate) and DP (α,α-dipyridyl) inhibitor to the medium. Although a reduction in pollen tube length was observed for p4h4 p4h6 double mutant, these phenotype could not be explained by changes of the pectin content and deposition, since this polysaccharide remains unaltered at the cell wall. Finally, we observed the subcellular localization of P4H4 in the endoplasmic reticulum/Golgi apparatus of growing pollen tubes. Further analysis is required to explore the implication of other/s P4H enzyme/s, besides P4H4 and P4H6, in HRGP hydroxylation and to study deeply the relevance of this PTM over pollen structural proteins.