Bases genéticas de la evolución del cerebro humano: Estudio comparativo de la regulación transcripcional del factor de transcripción NPAS3

Abstract

Se ha propuesto que la divergencia fenotípica entre humanos y chimpancés se debe en gran medida a cambios en la regulación de genes que participan en el desarrollo en lugar de cambios en las secuencias codificantes de proteínas de los genes. Hipotetizamos que la explosión sin precedentes en el repertorio del comportamiento humano se debe a la adquisición de nuevos patrones de expresión de genes preexistentes. Previamente en nuestro laboratorio, se analizó la distribución en el genoma de secuencias genómicas no codificantes (denominados human accelerated elements, HAE) que muestran evidencia de evolución acelerada en el linaje humano (aumento en la tasa de sustitución de nucleótidos). Esto permitió identificar la agrupación más grande de HAEs en el genoma humano ubicada dentro del locus del gen que codifica para la proteína neuronal PAS domain-containing protein 3 (NPAS3). NPAS3 codifica un factor de transcripción bHLH-PAS que se expresa ampliamente en el sistema nervioso en desarrollo del ratón y de humano, y su disfunción se ha asociado con la etiología de la esquizofrenia y el síndrome bipolar en humanos. En el locus de este gen se agrupan 14 HAEs. En este trabajo, realizamos un ensayo comparativo utilizando las secuencias ortólogas de humano y de chimpancé, para determinar si los 14 elementos NPAS3-HAEs funcionan cómo activadores transcripcionales o enhancers en líneas de peces cebra y ratones transgénicos. Identificamos dos NPAS3-HAEs (HAR202 y HACNS658) en los que la versión humana perdió función cómo enhancer en comparación con la versión de chimpancé, que funciona como un fuerte enhancer durante el desarrollo del cerebro. Para determinar si la función enhancer se perdió en el linaje humano o lo que ocurrió fue una ganancia de función en el linaje de chimpancé, seleccionamos el elemento HAR202 y realizamos estudios comparativos con secuencias de mono macaco Rhesus, ratón y pez cebra. Encontramos que el elemento HAR202 perdió específicamente su función enhancer como consecuencia del proceso evolutivo en el linaje humano. Para analizar cuál es el efecto funcional de la perdida de HAR202 sobre la expresión del gen NPAS3 generamos III un linaje de ratones mutantes que carece de este elemento en el genoma. Además, identificamos un elemento regulatorio, HACNS96 que ganó función de activador transcripcional en el sistema nervioso central en el linaje humano. Por otra parte, ha sido ampliamente estudiada la función del gen NPAS3 en el desarrollo del cerebro y también en el desarrollo de las vías respiratorias. Sin embargo, ha sido postulado que este gen podría participar también en el desarrollo craneofacial ya que personas que presentan una deleción en su genoma que incluye al gen NPAS3 presentan holoprocensefalia. La holoprosencefalia (HPE) es la anomalía del desarrollo más común que afecta el patrón del prosencéfalo humano y las estructuras craneofaciales asociadas. Para investigar si npas3 está involucrado en el desarrollo de estructuras craneofaciales, realizamos estudios de genética molecular en el pez cebra. El análisis de npas3 de peces cebra mutantes nulos (knockout) y en los que se indujo una marcada reducción de la expresión (knockdown) reveló anormalidades craneofaciales críticas que indican que este gen desempeña un papel clave en el desarrollo de estas estructuras. Además, npas3 demostró ser esencial para el desarrollo del sistema nervioso y del sistema branquial en el pez cebra. Curiosamente, la ablación o reducción de npas3 afecta la expresión de sonic hedgehog (shha), un gen maestro del desarrollo que cuando se muta produce holoprocencefalia. Nuestros resultados sugieren el gen NPAS3 desempeña un papel en el desarrollo craneofacial.

It has been proposed that the phenotypic divergence between humans and chimpanzees is largely due to changes in the regulation of genes involved in the development rather than changes in the protein coding sequences of the genes. We hypothesize that the explosion unprecedented in the repertoire of human behavior is due to the acquisition of new patterns of expression of pre-existing genes. Previously in our laboratory, the genome distribution of non-coding genomic sequences (called human accelerated elements, HAE) that show evidence of accelerated evolution in the human lineage (increase in the rate of nucleotide substitution) was analyzed. This allowed to identify the largest group of HAEs in the human genome located within the locus of the gene that codes for the neuronal protein PAS domain-containing protein 3 (NPAS3). NPAS3 encodes a transcription factor bHLH-PAS that is widely expressed in the developing nervous system of the mouse and human, and its dysfunction has been associated with the etiology of schizophrenia and bipolar syndrome in humans. In the locus of this gene, 14 HAEs are grouped. In this work, we conducted a comparative trial using the human and chimpanzee orthologous sequences, to determine if the 14 NPAS3-HAEs elements function as transcriptional activators or enhancers in lines of zebrafish and transgenic mice. We identified two NPAS3-HAEs (HAR202 and HACNS658) in which the human version lost function as an enhancer compared to the chimpanzee version, which functions as a strong enhancer during brain development. To determine if the enhancer function was lost in the human lineage or what happened was a gain of function in the chimpanzee lineage, we selected the HAR202 element and made comparative studies with sequences of Rhesus macaque, mouse and zebrafish monkey. We found that the HAR202 element specifically lost its enhancer function because of the evolutionary process in the human lineage. To analyze what is the functional effect of the loss of HAR202 on the expression of the NPAS3 gene, we generated a lineage of mutant mice lacking this element V in the genome. We also identified a regulatory element, HACNS96 that gained transcriptional activator function in the central nervous system in the human lineage. On the other hand, the role of the NPAS3 gene in the development of the brain and in the development of the respiratory tract has been widely studied. However, it has been postulated that this gene could also participate in the craniofacial development since people who present a deletion in their genome that includes the NPAS3 gene present holoprocensephaly. Holoprosencephaly (HPE) is the most common developmental anomaly that affects the pattern of the human forebrain and the associated craniofacial structures. To investigate if npas3 is involved in the development of cranio-facial structures, we conducted molecular genetic studies in zebrafish. The analysis of npas3 of zebrafish mutants’ nulls (knockout) and in which a marked reduction of expression was induced (knockdown) revealed critical skull-facial abnormalities that indicate that this gene plays a key role in the development of these structures. In addition, npas3 proved to be essential for the development of the nervous system and the branchial system in the zebrafish. Interestingly, the ablation or reduction of npas3 affects the expression of sonic hedgehog (shha), a master gene of development that, when mutated, produces holoprocensephalia. Our results suggest the NPAS3 gene plays a role in craniofacial development.