Disección funcional de enhancers transcripcionales específicos del gen del receptor de dopamina D2 (Drd2) mediante el uso de ratones transgénicos

Abstract

El receptor de dopamina D2 (D2R) juega un rol fundamental en la integración de respuestas motoras, emocionales y cognitivas y está involucrado en enfermedades neurológicas y psiquiátricas de alta prevalencia, que incluyen la enfermedad de Parkinson, la esquizofrenia y la administración compulsiva de drogas de abuso. A pesar de su importancia, los mecanismos moleculares que controlan la expresión de Drd2 en los distintos tipos celulares son desconocidos. En este trabajo realizamos un estudio de las regiones conservadas presentes en el locus de Drd2 con el objetivo de investigar si dirigen la expresión de transgenes reporteros en diferentes áreas y tipos celulares del cerebro y de la hipófisis del ratón. Mediante el uso de cromosomas artificiales bacterianos (BAC) recombinantes generamos inicialmente ratones transgénicos portadores de construcciones de gran tamaño que permitieron identificar una región de 60 kb que dirige la expresión de un gen reportero a distintos tipos neuronales y celulares donde normalmente se expresa Drd2. A partir de esa información realizamos una disección genética y funcional de esta región de 60 kb. Un fragmento de 15 kb, que incluye el primer exón de Drd2, y otro de 7 kb, localizado en extremo 3? del primer intrón, dirigen la expresión de genes reporteros a diferentes áreas del cerebro. Mientras la primera tiene como área de dominio principal al septum lateral, la segunda activa la expresión en el núcleo estriado y en las áreas dopaminérgicas del cerebro medio. En este último fragmento identificamos dos elementos conservados de aproximadamente 500 pares de bases, que funcionan como enhancers transcripcionales, dirigiendo la expresión reportera a distintas poblaciones neuronales, uno a neuronas estriatales y el otro a neuronas pertenecientes al cerebro medio. Estos resultados constituyen un paso fundamental para comprender el código de elementos regulatorios que controlan la expresión de Drd2 y aporta nuevas herramientas genéticas para estudiar la participación del D2R en diferentes tipos celulares y circuitos neuronales.

The dopamine D2 receptor (D2R) plays a major role in the integration of motor, emotional and cognitive responses, is also involved in neurological and psychiatric diseases of high prevalence. Despite its significance, the molecular mechanisms that control the expression of the D2R gene (Drd2) in different tissues remain unknown. In this work we studied the conserved regions in the Drd2 locus, with the aim of testing their capacity to direct reporter gene expression to the different areas and cellular types in mouse brain and pituitary. By using recombineering techniques in bacterial artificial chromosomes (BAC) we were able to produce transgenic mice harboring large transgenes. This allowed us to identify a 60 kb region capable of directing gene reporter expression to several neural and cellular types where Drd2 is normally expressed. From here we made a genetic and functional dissection of the 60 kb region. One 15 kb fragment, which includes the first exon of Drd2, and other of 7kb, at 3’ of the first intron, are capable of directing reporter genes to different brain regions. Whereas the first dominates mainly the expression on lateral septum, the second activates expression on the striatal nucleus and dopaminergic midbrain areas. In this last fragment we found two conserved elements approximately of 500 pair base long that work like transcriptional enhancers directing the reporter expression to different neuronal population, one to striatal neurons and the other to midbrain neurons. These results establish a fundamental step in the comprehension of the regulatory elements code that control Drd2 expression and, furthermore, contribute to the development of new genetic tools for the study of D2R function on different cellular types and neuronal circuits.