Identificación y caracterización de genes involucrados en el desarrollo del endospermo en cariopsis de Paspalum notatum

Abstract

La especie Paspalum notatum Flüggé (P. notatum) es utilizada como modelo en genética reproductiva vegetal debido a que presenta citotipos diploides de reproducción sexual y citotipos poliploides apomícticos y pseudógamos. Esta característica permitió evaluar: 1- El efecto directo del genotipo del polen en el desarrollo y características de la semilla y fruto (efecto xenia) y 2- Las diferencias durante la formación de semillas entre citotipos apomícticos y sexuales.En el capítulo I, se exploró el efecto xenia, el cual se define como el efecto directo del genotipo del polen en el desarrollo de la semilla o fruto. Tiene gran importancia agronómica, utilizándose en el mejoramiento genético vegetal, por ejemplo, en la búsqueda del incremento del rendimiento de granos. Aunque se reportan numerosos estudios sobre xenia, su efecto a nivel molecular ha sido poco estudiado. Por ello, se realizó un estudio molecular utilizando la especie P. notatum. Los objetivos del presente trabajo fueron: 1- Analizar el efecto de xenia en el desarrollo del endospermo a nivel molecular. 2- Evaluar si los genes expresados diferencialmente ejercen funciones durante el desarrollo de la semilla. 3- Explorar los procesos metabólicos y la(s) molécula(s) señal(es) que median el efecto xenia en el endospermo. Para ello, luego de tres horas de ocurrida la polinización, momento en el que ya ha ocurrido la fecundación de los núcleos polares, se realizó la comparación mediante cDNA-AFLP de una planta madre testigo sin polinizar, de genotipo Q4117 (4x apomíctico pseudógamo), con respecto a dos cruzamientos de esta madre con distintos dadores de polen: Q4117xH398 (2x sexual) y Q4117xQ3775 (4x apomíctico pseudógamo). Del análisis de la expresión génica diferencial se obtuvieron bandas únicas, tanto para el cruzamiento Q4117xH398 como para el cruzamiento Q4117xQ3775. A partir del análisis del patrón de bandas obtenidas, se encontraron 33 bandas de expresión diferencial únicas para los cruzamientos analizados, de las cuales 24 fueron secuenciadas, y se les asignó una posible función biológica mediante búsquedas blastn, blastx y blastp. Del análisis funcional de secuencias se obtuvo que siete de ellas (CG5, GA4, GA6, GG5, CG3, TG2 y CC1) presentaron homología con loci de Arabidopsis thaliana (A. thaliana) con funciones asociadas al desarrollo del saco embrionario, desarrollo del tubo polínico, doble fertilización, formación del cigoto y el endospermo. En artículos previos se puso en evidencia que al generarse fenotipos mutantes de A. thaliana para estos loci el tamaño de la silicua, el número, tamaño y el set de semillas (porcentaje de semillas llenas con respecto al número total de semillas) disminuye. Estos resultados mostraron evidencias del efecto xenia en las funciones asociadas a la reproducción y de que el genotipo del polen es uno de los factores que determinan la expresión de diferentes transcriptos que podrían estar asociados con el rendimiento de granos. Además, las secuencias CC3, GA4, GA6 y GA2 estuvieron asociadas a loci de A. thaliana que codifican para ARNm móviles, lo cual sería evidencia de que el mecanismo para xenia estaría relacionado con ARNm móviles que difundirían desde el tubo polínico por la micrópila del óvulo.En el capítulo II se trabajó en base a la teoría del número de balance endospérmico (NBE), la cual establece que la relación de las contribuciones genómicas debe ser 2materna:1paterna para el normal desarrollo del endospermo. Sin embargo, las plantas apomícticas de P. notatum son NBE insensibles. Los objetivos del presente trabajo fueron: 1) Realizar cruzamientos entre diferentes genotipos, a fin de generar semillas con distintos niveles de ploidía por las vías sexual y apomíctica. 2) Realizar un análisis de la expresión génica diferencial 48h luego de ocurrida la polinización (LOP). Para ello, a partir del ARNm de 20 ovarios de cada cruzamiento 48h LOP, se llevó a cabo el análisis de la expresión génica diferencial mediante la técnica cDNA-AFLP. Se obtuvieron numerosas secuencias candidatas: AC1, AC2, AC3, AC4, AC5, GG1 y GG3 para ser utilizadas en futuros análisis funcionales en A. thaliana, las cuales se expresarían en distintos estadíos de desarrollo de la semilla y estarían relacionadas con el desarrollo del endospermo y con la viabilidad o no de la semilla en P. notatum.En el capítulo III se trabajó sobre el silenciamiento génico post-transcripcional en A. thaliana a patir de secuencias candidatas de P. notatum. Para ello, se evaluó en primer lugar la eficiencia del método de transformación por Floral dip mediante la expresión transitoria del gen gus. Posteriormente, se seleccionó la secuencia candidata GG13 (gen GG13) de P. notatum con el objetivo de ser silenciada en A. thaliana y se generó un hpRNA, el cual contenía las secuencias del gen GG13 en sentido y anti-sentido separadas por un intrón. Se validó el silenciamiento mediante una RT-qPCR y el subsiguiente cálculo de expresiones relativas. Además, se evaluaron caracteres fenotípicos en silicuas de plantas silenciadas y control. Los resultados obtenidos a partir del análisis fenotípico permitieron concluir que el gen GG13 afecta tempranamente el número y la forma de las semillas y el largo de silicua. Por lo tanto, se evidenció la correspondencia entre los resultados obtenidos por el análisis funcional con lo predicho por el análisis bioinformático.