Estudios serológicos, biológicos y moleculares de Toxoplasma gondii y su relación con la transmisión transplacentaria en infecciones naturales en cabras

Abstract

Toxoplasma gondii es un parásito protozoario que se encuentra distribuido mundialmente y que afecta a un amplio rango de mamíferos y aves causando la enfermedad denominada toxoplasmosis. En pequeños rumiantes la toxoplasmosis es considerada una causa importante de problemas reproductivos. El signo más característico de esta infección en caprinos es la presencia de abortos y natimortos, aunque también puede producir muerte embrionaria, nacimiento de cabritos débiles o de animales clínicamente normales pero infectados.En este trabajo se determinó la seroprevalencia de la toxoplasmosis caprina en Argentina a través de la detección de anticuerpos anti-T. gondii en sueros de cabras (n= 4092) de 209 establecimientos por la prueba de Inmunofluorescencia Indirecta (IFI) en las provincias de: Buenos Aires (n= 735), Córdoba (n= 2187), San Luis (n= 389), La Rioja (n= 237), Río Negro (n= 123), Catamarca (n= 219) y Salta (n= 202). Además se determinaron las diferencias entre los distintos sistemas de manejo semi-intensivo/intensivo (n= 1235) y extensivo (n= 2766). La seroprevalencia de anticuerpos anti-T. gondii hallada en el país fue del 39 % (1596/4092). Todas las provincias analizadas y el 76,1 % (159/209) de los establecimientos presentaron animales seropositivos a T. gondii. Las seroprevalencias fueron diferentes entre regiones, siendo las más altas en las provincias de Catamarca (71 %), Buenos Aires (63 %) y Río Negro (51,2 %), y las más bajas en Salta (27,7 %), La Rioja (22,4 %) y San Luis (19,8 %), mientras que Córdoba presentó una seroprevalencia intermedia (33,3 %) (p <0,0001). Se detectó una seroprevalencia del 56,8 % (701/1235) y del 30,9 % (864/2766) en establecimientos con manejo semi-intensivo/intensivo y extensivo, respectivamente. La seroprevalencia fue significativamente mayor en explotaciones lecheras con manejo semi-intensivo/intensivo (p<0,0001; OR= 2,94). De acuerdo a lo resultados obtenidos es posible concluir que la toxoplasmosis caprina se encuentra ampliamente distribuida en el país y que las diferencias encontradas entre las distintas regiones de Argentina podrían deberse al sistema de producción de los animales, condiciones climáticas y/o características geográficas. Se evaluó una prueba de ELISA con el antígeno nativo TgSAG1 (P30) de T. gondii (ELISA-P30) para el diagnóstico de la toxoplasmosis en caprinos. Se utilizaron 478 sueros de distintas provincias con resultados concordantes a las pruebas de IFI e Immunoblot como estándar relativo de comparación (ERC). El análisis por curva ROC determinó que el ELISA-P30 fue altamente preciso con un área bajo la curva (AUC) de 0,9788 y una concordancia casi perfecta (k= 0,9381) en relación al ERC. Se obtuvieron valores de 96 % y 98 % de sensibilidad y especificidad respectivamente, con el valor de índice relativo de 0,2185 como cutoff. El ELISA-P30 se validó para la detección de anticuerpos anti- T. gondii en cabras naturalmente infectadas de nuestro país.Se estudiaron tejidos de 54 fetos caprinos (que incluyeron abortos, natimortos y muertos perinatales), 35 placentas y 42 sueros de cabritos antes de ingerir calostro (sueros precalostrales) para determinar la transmisión vertical, la tasa de abortos y caracterizar molecularmente los genotipos de T. gondii presentes en infecciones naturales de cabras. Las muestras de suero y líquidos fetales se analizaron mediante la prueba de IFI. Los homogenatos de SNC de 11 fetos se inocularon por vía subcutánea en ratones para realizar el aislamiento. Los tejidos fetales, las placentas caprinas y los tejidos de ratones inoculados fueron analizados por la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Las muestras positivas por PCR fueron sometidas a genotipificación por PCR anidada (nested-PCR) seguida por cortes con enzimas de restricción (RFLP) utilizando los marcadores moleculares nSAG 2, SAG3, BTUB, GRA6, L358, c22-8, c29-2, PK1 y Apico. El 13 % (7/54) de los fetos analizados fueron positivos a T. gondii, en todos se detectó ADN del protozoo en tejidos, principalmente en SNC. En un feto se detectaron anticuerpos para T. gondii. El 17,6 % (6/34) de las placentas analizadas presentaron ADN de T. gondii. No se logró el aislamiento del parásito a partir de las muestras inoculadas. En este estudio la transmisión de la infección a los fetos no se relacionó con seroconversión en sueros de las madres. Los 42 sueros precalostrales evaluados fueron negativos a IFI, a pesar que el 85,7 % de los cabritos sangrados eran hijos de cabras seropositivas. En nuestro estudio pudimos confirmar que la transmisión transplacentaria de T. gondii ocurrió en el 13,3 % de las cabras con pérdidas reproductivas provenientes de 2 establecimientos de la provincia de Buenos Aires con altas seroprevalencias. La transmisión vertical de T. gondii manifestada por el nacimiento de cabritos asintomáticos infectados tendría una limitada participación en el mantenimiento de la infección en hatos caprinos con alta seroprevalencia.Para la caracterización molecular de T. gondii se analizaron muestras de ADN de tejidos de 6 fetos y 3 placentas. Se obtuvieron genotipificaciones completas en tejidos de 2 de los casos de abortos, mientras que en el resto de las muestras se obtuvieron genotipificaciones parciales. El genotipo hallado en muestras de tres fetos (trillizos) fue atípico, con la mayoría de los marcadores tipo III, con excepción de C29-2 (tipo II), L358 y PK1 (ambos tipo I) y el otro genotipo presentó un patrón alélico tipo II y fue obtenido partir de una placenta con lesiones características. Los genotipos de T. gondii que afectaron a los caprinos en Argentina en su mayoría fueron atípicos con predominio de marcadores tipo III y se relacionaron con los genotipos detectados en otros hospedadores de la misma región. En la provincia de Buenos Aires fue factible detectar el genotipo II asociado a abortos en caprinos. Teniendo en cuenta que los sistemas de producción semi-intensivos/intensivos en nuestro país se dedican principalmente a la producción de leche y sus derivados, se recomienda tomar medidas para reducir la infección horizontal de los caprinos.

Toxoplasma gondii is a protozoan parasite with a worldwide distribution that affects a wide range of mammals and birds, causing toxoplasmosis. In small ruminants toxoplasmosis is considered an important cause of reproductive disorders in many countries. The most common clinical signs of toxoplasmosis in goats are abortion and stillbirth. It can also cause embryonic death, neonatal death, birth of weak kids or clinically normal but infected kids. In the present study, the seroprevalence of T. gondii in goats from Argentina was estimated by Indirect Fluorescent Antibody Test (IFAT). Antibodies to T. gondii were determined in goat serum samples (n= 4092) belonging to 209 herds from Buenos Aires (n= 735), Córdoba (n= 2187), San Luis (n= 389), La Rioja (n= 237), Río Negro (n= 123), Catamarca (n= 219) and Salta (n= 202) provinces. Additionally, the differences between semi-intensive/intensive (n= 1235) and extensive (n= 2766) management conditions were determined. Overall, T. gondii seroprevalence was 39% (1596/4092). All provinces and 76.1 % (159/209) of herds had seropositive animals. Seroprevalence values varied between regions, being higher in Catamarca (71 %), Buenos Aires (63 %) and Río Negro (51.2 %) and lower in Salta (27.7 %), La Rioja (22.4 %) and San Luis (19.8%), while Córdoba had an intermediate seroprevalence value (33.3%) (p< 0.0001). A seroprevalence of 56.8 % (701/1235) and 30.9 % (854/2766) was detected in farms with semiintensive/intensive and extensive management systems, respectively. The seroprevalence was significantly higher in dairy farms with semiintensive/intensive management conditions (p< 0.0001; OR = 2.94). According to these results, it is possible to conclude that caprine toxoplasmosis is widely distributed in the country and that differences among regions could be attributed to different animal production systems, weather conditions and/ or geographic characteristics. An ELISA test using the TgSAG1 (P30) native antigen of T. gondii (P30-ELISA) was evaluated for the diagnosis of caprine toxoplasmosis. 478 goats serum samples from different provinces of Argentina testing either positive or negative by both IFAT and IB were used as relative standard of comparison (RSC).The Receiver Operating Characteristics (ROC) analysis revealed that P30-ELISA was highly accurate with an area under curve (AUC) of 0.9788 and an almost perfect agreement (k = 0.9381) according to the RSC. Relative sensitivity and specificity of the P30-ELISA using a cut-off index value of 0.2185 were 96 % and 98 %, respectively. The P30-ELISA was validated for detection of antibodies against T. gondii in naturally infected goats in our country. Fifty-four goat fetuses (from abortions, stillbirths and neonatal deaths), 35 caprine placentas and 42 sera from kids before ingesting colostrum were studied to determine vertical transmission, abortion rate and molecular characterization of T. gondii genotypes in natural goat infections. Serum samples and fetal fluids were examined by IFAT. Brains from 11 fetuses were homogenized and inoculated subcutaneously into mice for isolation attempts. Caprine fetal tissues, placentas and tissues from inoculated mice were analyzed by the polymerase chain reaction (PCR) for T. gondii detection. Positive T. gondii DNA samples were genotyped by nested polymerase chain reaction- restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) using the amplified markers nSAG 2, SAG3, BTUB, GRA6, L358, c22-8, c29-2, PK1 and Apico. Thirteen percent (7/54) of the analyzed fetuses were T. gondii positive, mainly in SNC. One fetus had antibodies against T. gondii. Toxoplasma gondii DNA was detected in 17.6% (6/34) of the placentas. Succesful isolation of T. gondii from the inoculated samples was not achieved. In this study, seroconversion was not detected in mothers when fetal infection occurred. The 42 sera of kids before ingesting colostrum were negative by IFAT, although 85.7 % of the kids were born from seropositive goats. In our study, we confirmed that transplacental transmission of T. gondii occurred in 13.3 % of goats with reproductive losses, from 2 herds with high seroprevalences in Buenos Aires province. All cases where T. gondii vertical transmission was confirmed resulted in abortion, stillbirths or neonatal deaths. Vertical transmission of T. gondii in clinically normal kids seems to have little importance in maintaining the infection in herds with high seroprevalence. DNA samples from 6 fetal tissues and 3 placentas were used for molecular characterization of T. gondii. Complete genotyping was achieved in tissues from 2 cases of goat abortion, while the rest of the samples could be partially genotyped. The genotype from three fetuses (triplets) was identified as atypical, with most markers showing a type III restriction pattern, except C29-2 (type II), L358 and PK1 (both type I), and another complete genotype from a placenta showed a type II allelic pattern in this study. The genotypes of T. gondii that infected goats in Argentina were mostly atypical with a predominance of type III markers and were related to the genotypes found in other hosts of the same region. In Buenos Aires province it was possible to find genotype II associated with goat abortions. In our country, semi-intensive/intensive production systems are mainly dedicated to the production of dairy products, therefore, it is highly recommended to follow the necessary control measures in order to reduce possible T. gondii horizontal infection in goats.