Estudios biológicos e inmunológicos de aislamientos de Toxoplasma gondii provenientes de animales de zoológico en Argentina

Abstract

Toxoplasma gondii es un parásito intracelular obligado que afecta a mamíferos y aves que posee un ciclo de vida indirecto. Su virulencia es variable de acuerdo con la susceptibilidad de la especie afectada y del genotipo involucrado en la infección. Los aislamientos de T. gondii se han identificado genéticamente a nivel mundial como “clonales” denominándose tipo I, II y III. Sin embargo, en Sudamérica se ha encontrado la presencia de aislamientos no clonales o “atípicos”. El objetivo principal de este trabajo fue evaluar el comportamiento biológico de dos aislamientos de T. gondii, identificados genéticamente como atípicos, provenientes de los animales de zoológico Saimiri boliviensis (mono ardilla boliviano) y Macropus rufogriseus (walaby de Bennet), (denominados TgSb y TgMr, respectivamente) en Argentina y evaluar la respuesta inmune de ratones infectados experimentalmente con estos. Se realizó la genotipificación de 29 muestras de ADN de T. gondii de Argentina mediante nPCR-RFLP para 10 marcadores moleculares. Con los resultados obtenidos se realizó una red filogenética utilizando el software SplitsTree4. Se evaluaron los aislamientos TgSb y TgMr en comparación con las cepas de referencia RH, ME49 y VEG (tipos clonales I, II y III respectivamente) en un ensayo in vitro. Se realizaron seis ensayos independientes (tres de 6 h de duración y tres de 18 h de duración) con tres réplicas cada uno. A continuación, se realizó inmunofluorescencia indirecta sobre los cubreobjetos para contar la cantidad de vacuolas parasitóforas (invasión) y la cantidad de taquizoítos dentro de cada vacuola (replicación). Para evaluar la morbi-mortalidad se utilizaron ratones Swiss (n = 30) y se distribuyeron en 5 grupos inoculados con taquizoítos (dosis de infección 102 y 103 ) de TgSb y TgMr, las cepas ME49 y VEG y control negativo. Se evaluó la respuesta inmune celular por medio del cultivo de células esplénicas y desafío de los cultivos con antígeno de lisado total parasitario (TLA) producido a partir de las cepas RH, ME49, VEG y de los aislamientos TgSb y TgMr. Los sobrenadantes se analizaron con un kit de ELISA para la detección de IFN- Ꝩ murino. Se identificaron 17 genotipos diferentes en Argentina, incluyendo 5 “nuevos” e incorporados a la base de datos ToxoDB (# 283, # 284, # 285, # 286, y # 287). La caracterización molecular completa de TgSb y TgMr confirmó su condición de atípicos siendo identificados como genotipos # 163 y # 14, respectivamente. Los resultados in vitro indicaron que los aislamientos TgMr y TgSb tienen un comportamiento más virulento que las cepas ME49 y VEG con semejanzas al tipo clonal virulento RH en su baja capacidad de invasión (TgMr) como en su alta capacidad de replicación (TgSb). La replicación y la velocidad de duplicación serían los factores más importantes para evaluar en estudios in vitro como indicadores de virulencia. Se estableció un índice in vitro de invasión – replicación y el resultado demostró que RH, TgSb y TgMr presentaron los menores valores, que se asociaron inversamente con la mayor virulencia. Ambos aislamientos presentaron una morbi-mortalidad del 100 %, teniendo una virulencia mayor que las cepas de referencia II y III. Considerando los bajos índices invasion – replicación de TgSb y TgMr se postula la presencia y expresión de otros factores que se relacionen con su elevada virulencia. El estímulo con TLA de RH indujo la producción de niveles significativamente altos de IFN- Ꝩ en los sobrenadantes de los ratones infectados con los aislamientos TgMr y TgSb, indicando la presencia de una respuesta inmune adaptativa con la producción de linfocitos específicos orientados hacia un perfil Th1. La sobre producción de esta citoquina podría relacionarse con la expresión/secreción de moduladores de la respuesta inmune por parte de estos protozoos y se vincularía con la mayor virulencia detectada en el modelo in vivo. Ambos genotipos (# 163 y # 14) presentaron un fenotipo de alta virulencia, tanto in vitro como in vivo, aunque se agruparon en la red filogenética en cercanías del tipo clonal III. Por lo dicho anteriormente, se propone el uso de estudios in vitro previo al estudio in vivo para minimizar la utilización de animales en estudios de caracterización de aislamientos de T. gondii. El establecimiento de un índice in vitro de invasiónreplicación podría ser de utilidad para predecir virulencia de modo indirecto: bajo valor del índice se relaciona con alta virulencia (morbi-mortalidad) en modelo murino. La respuesta Th1 con sobre producción de IFN-γ sería el mecanismo preponderante en infecciones con genotipos virulentos.

Toxoplasma gondii is an intracellular parasite with an indirect life cycle infecting mammals and birds. Its virulence is variable according susceptibility of host species and parasite genotypes. Toxoplasma gondii isolates have been genetically identified as "clonal" and named type I, II and III. However, in South America the presence of non-clonal or atypical isolates has been reported. The aim of this study was to evaluate the biological behavior of two isolates of T. gondii, genetically identified as atypical, isolated from the zoo animals Saimiri boliviensis (bolivian squirrel monkey) and Macropus rufogriseus (Bennett's wallaby) (named as TgSb and TgMr, respectively) in Argentina and to evaluate the immune response of experimentally infected mice. Genotyping of 29 DNA samples of T. gondii from Argentina was performed by nPCR-RFLP using 10 molecular markers. With the results, a phylogenetic network was made using the SplitsTree4 software. The isolates TgSb and TgMr were evaluated in comparison with the reference strains RH, ME49 and VEG (clonal types I, II and III, respectively) in an in vitro assay. Six independent trials were performed (three of 6 h and three of 18 h long) with three replicates each. Indirect immunofluorescence was performed over the coverslips to count the number of parasitophorous vacuoles (invasion) and the amount of tachyzoites within each vacuole (replication). To evaluate the morbidity and mortality, Swiss mice (n = 30) were distributed in 5 groups inoculated with tachyzoites (doses of infection 102 and 103 ) of TgSb and TgMr, the strains ME49 and VEG and negative control. The cellular immune response was evaluated by culturing splenic cells and challenging the cultures with total lysate antigen of the parasite (TLA) from strains RH, ME49, VEG and isolates TgSb and TgMr. The supernatants were analyzed with an ELISA kit for the detection of murine IFN-Ꝩ. We identified 17 different genotypes in Argentina, including 5 "new" and incorporated into the ToxoDB database (# 283, # 284, # 285, # 286, and # 287). The complete molecular characterization of TgSb and TgMr confirms its atypical condition as genotypes # 163 and # 14, respectively. The in vitro results indicate that the isolates TgMr and TgSb have a more virulent behavior than the strains ME49 and VEG, with similarities to the virulent clonal type RH in its low invasion capacity (TgMr) as well as in its high replication capacity (TgSb). Replication and duplication speed are the most important factors to evaluate in the in vitro studies as virulence indicators. An in vitro index of invasion-replication was performed, and the result showed that RH, TgSb and TgMr have the lowest values, which are inversely associated with greater virulence. Both isolates had a 100% morbimortality in mice, having a higher virulence than the reference strains type II and III. Considering the low invasion-replication index identified for TgSb and TgMr we considered that presence and expression of other factors should be associated with their high virulence. The stimulation with TLA from RH induced the production of high levels of IFN- Ꝩ in the supernatants of the mice infected with the isolates TgMr and TgSb, indicating the presence of an adaptive immune response with the production of lymphocytes with a Th1 profile. The overproduction of this cytokine could be related to the expression / secretion of modulators of the immune response by these protozoa and would be linked to the greater virulence detected in the in vivo model. Both genotypes (# 163 and # 14) present a high virulence phenotype, in vitro and in vivo, although they were grouped in the phylogenetic network in proximity with the clonal type III. According to the obtained results, the use of in vitro studies before the in vivo studies is proposed to minimize the use of animals in the characterization of T. gondii isolates. The establishment of an in vitro index of invasion-replication could be useful to predict the virulence in an indirect mode: low index related with high virulence (morbidity-mortality) in murine model. The Th1 response with IFN-γ overproduction appears to be the predominant mechanism on infections with virulent genotypes.