Genómica comparativa y funcional aplicada a los mecanismos involucrados en el desarrollo hacia la extrema y pandroga resistencia antibiótica

Abstract

El informe de la Organización Mundial de la Salud (OMS), publicado en Enero de 2018, advierte acerca del aumento alarmante en los niveles de la Resistencia a Antibióticos (RAM) en todo el mundo. La Transferencia Horizontal Genética (THG) de Genes de Resistencia a Antibióticos (GRA) desempeña un papel fundamental en la evolución de las bacterias hacia la Multidroga Resistencia Antibiótica (MDRA). La hipótesis general de esta tesis es que el análisis de las características genómicas, moleculares y funcionales del gen intI1 en la adaptación a diferentes hábitats y taxones así como hacia los fenotipos MDRA y XDRA, nos aportarán datos precisos que nos permitirán colaborar en el diseño de estrategias dirigidas al uso racional de antibióticos teniendo como base información adaptativa y molecular locales con una perspectiva global. Tomamos como modelo biológico el estudio molecular del gen intI1 de los integrones de clase 1, clave en la captación y expresión de la resistencia antibiótica móvil. Por lo tanto, en una primera etapa, construimos una base de datos local compuesta por 1153 secuencias del gen intI1 de cepas ambientales y clínicas. Identificamos un total de 90 alelos del gen intI1, de los cuales 37 eran ―ambientales‖, 44 eran ―clínicos‖ y 9 eran ―multi-hábitat‖. Dentro de estos últimos, 4 alelos eran los más frecuentes (KF040452, KJ186152, AF313471 y AY509004), lo cual nos permite inferir el carácter generalista del gen intI1 que es funcional en todo tipo de nichos. Mediante un estudio filogenético de los alelos, evidenciamos la existencia de ―microhábitats‖ que funcionan como reservorios ambientales del gen intI1, ya que, el 77,2% de los 44 alelos ―clínicos‖ del gen intI1 eran alelos únicos que posiblemente representen ―capturas esporádicas‖ del gen intI1 del ambiente hacia la clínica. Los diferentes alelos del gen intI1 se encontraron mayoritariamente en plásmidos de especies patógenas humanas resaltando la importancia de la THG en la diseminación de los integrones de clase 1. Mediante ensayos de mantenimiento del gen intI1, evidenciamos que en las cepas clínicas, el gen intI1 es mantenido y heredado verticalmente en el 100% de las colonias testeadas (90 colonias al día 30 en 3 estudios independientes) en linajes con comportamiento epidémico tal como la cepa K. pneumoniae Kpn666 perteneciente al ST 258, y la cepa A. baumannii A144 perteneciente al Clon Internacional 1, al igual que en la cepa S. marcescens Sm909 de brote intrahospitalario y también en la cepa P. aeruginosa PAE981 aislada de un paciente con Fibrosis Quística (FQ). Los resultados obtenidos evidencian un flujo dinámico de los alelos del gen intI1 en particular en nichos humanos (tracto oral y gastrointestinal y cepas patógenas) que han permitido probablemente su expansión desde la aparición de los seres humanos especialmente desde la era antibiótica, en donde pueden perpetuarse por herencia vertical. En una segunda etapa, analizamos la adaptación de P. aeruginosa al pulmón de un paciente con FQ durante la colonización crónica. Se han descripto varios rearreglos genómicos que ocurren en esta especie a lo largo del tiempo en el pulmón del paciente con FQ, que Resumen Lic. Verónica Elizabeth Álvarez Genómica comparativa y funcional aplicada a los mecanismos involucrados en el desarrollo hacia la extrema y pandroga resistencia antibiótica 149 incluyen reducción genómica, conversión a fenotipo mucoide, producción de biofilm así como emergencia de cepas hipermutadoras, entre otros rearreglos. Secuenciamos los genomas completos de 4 cepas aisladas del paciente FQ1 (P. aeruginosa PAE969, P. aeruginosa PAE975, P. aeruginosa PAE977 y P. aeruginosa PAE981) y realizamos un análisis filogenético evidenciando la existencia de al menos 3 linajes nuevos. Las cepas P. aeruginosa PAE975 y PAE981 pertenecían al mismo linaje ST 2867 y poseían un 99,99% de identidad nucleotídica. Estas cepas evidenciaron acumulación de mutaciones patoadaptativas ya que detectamos nsSNP en los genes migA, phzE1, aroQ1, mucB, pctC, lasR, entre otros, que evidencian adaptación genómica durante la colonización/infección crónica de P. aeruginosa. Otro signo que denota la adaptación al pulmón FQ es la reducción genómica de 41468 pb en la cepa P. aeruginosa PAE981 que identificamos al comparar su genoma con el de la cepa P. aeruginosa PAE975 y P. aeruginosa PAO1. Sin embargo, simultáneamente a la reducción genómica, identificamos la THG de resistencia móvil, conferida por la adquisición de una nueva isla genómica PApGI, implicada en la diseminación de la resistencia a carbapenemes y aminoglucósidos, la cual porta un transposón Tn402 completo inserto en el transposón completo TnPa38, el cual a su vez posee un integrón de clase 1 que le proporciona un fenotipo XDRA a la cepa P. aeruginosa PAE981. De interés a nivel infectológico, observamos que la resistencia móvil adquirida, conferida por el gen cassette blaVIM-2, se mantiene a través del tiempo en más de 1000 generaciones, lo cual la convierte en un importante reservorio que potencialmente puede ser trasferido a otras cepas. En su conjunto, estos resultados evidencian el rol adaptativo que confieren los integrones de clase 1 a diversas especies y hábitats, incluyendo las infecciones crónicas de P. aeruginosa dentro de un mismo paciente con FQ.