Propiedades antitumorales in vitro e in vivo de una ftalocianina de zinc(II) lipofílica para uso en terapia fotodinámica

Abstract

Con el propósito de investigar la potencia fototóxica de Pcs lipofílicas, decidimos evaluar la eficacia de la ftalocianina 9 (Pc9) en una línea de células de adenocarcinoma orofaríngeo. Cuando se determinó la potencia de Pc9 disuelta en DMSO-agua se obtuvo un valor de IC50 de 120 nM, sin presentar toxicidad en la oscuridad. Sobre la base de este resultado, evaluamos luego si su capacidad fototóxica podía ser mejorada al ser incorporada en algún tipo de vehículo o carrier. Demostramos que Pc9 vehiculizada, ya sea en liposomas o micelas, induce la formación de especies reactivas de oxígeno (ROS) intracelulares y se localiza principalmente en lisosomas. Asimismo, mientras que algunos de estos vehículos resultaron tóxicos per se, otros permitieron reducir el valor de IC50, obteniendo la máxima potencia (IC50 = 10 nM) cuando Pc9 fue incorporada en las micelas de poloxamina denominadas T1107 y T1307. La mayor fotoestabilidad de Pc9 vehiculizada en T1107 con respecto a T1307 nos llevó a seleccionar la formulación Pc9-T1107 como la más potente y promisoria para continuar nuestros estudios. Teniendo en cuenta la importancia epidemiológica tanto a nivel mundial como nacional del carcinoma colorrectal (CCR), decidimos en una etapa posterior evaluar la eficacia de la TFD con Pc9-T1107 en líneas humanas y murinas de CCR. Puesto que en las distintas líneas ensayadas se obtuvieron valores similares de IC50 en cultivos bidimensionales (aproximadamente 10 nM), seleccionamos la línea celular murina CT26 como modelo de CCR para investigar el mecanismo de acción antitumoral de Pc9. El motivo de esta decisión obedeció no solo a las capacidades adquiridas en el laboratorio para generar modelos celulares más complejos, como esferoides o cultivos 3D, sino también a la posibilidad de estudiar modelos in vivo de esta patología originados a partir de esta línea celular. El análisis de los eventos moleculares involucrados en el proceso de muerte desencadenado en cultivos 2D por Pc9-T1107 reveló que la generación de ROS en lisosomas y retículo endoplásmico (RE), las principales organelas donde se localizó Pc9 intracelularmente, promovió la activación de una serie de blancos moleculares. La permeabilización de la membrana lisosomal, inducida por las ROS, produjo la liberación de una serie de proteasas al citosol, entre ellas Catepsina D, que contribuyó al clivaje de la proteína pro-apoptótica Bid y la activación de la procaspasa iniciadora 8. La fotoactivación de Pc9 en el RE activó una respuesta denominada UPR (del inglés unfolded protein response), indicio de estrés del RE. La UPR se caracterizó por un aumento en los niveles de expresión de ciertas chaperonas (GRP78/BIP, Calnexina, Hsp90 y Hsp110) que tienden a mantener la homeostasis celular. Además, se describió un incremento en los niveles de calcio intracelular que desencadenó la activación de calpaínas. Estas proteasas, a su vez, clivaron la procaspasa 12, una enzima que contribuye a la activación de una respuesta apoptótica. Asimismo, la participación de la vía de apoptosis mitocondrial fue evidenciada por la reducción en el potencial de membrana de esta organela, la disminución en los niveles de expresión de 168 proteínas anti-apoptóticas de la familia Bcl-2 y la activación de procaspasa 9. La consiguiente activación de procaspasa 3 provocó el clivaje de PARP-1 y el desenlace apoptótico con daño a nivel nuclear. En paralelo, la TFD promovió alteraciones del ciclo celular, mediante arresto en la fase G2/M y prolongación de la fase S, así como la activación de una respuesta macroautofágica tendiente a contrarrestar el efecto citotóxico de Pc9- T1107. Es sabido que la eficacia de una terapia antitumoral en cultivos bidimensionales no implica necesariamente su efectividad en la clínica. Existen numerosos aspectos de un cultivo que resultan simplificaciones con respecto al contexto en un paciente. En consecuencia, resulta indispensable evaluar las terapias en fase preclínica en modelos celulares y animales más complejos que los cultivos 2D. Teniendo en cuenta estas consideraciones, demostramos que la TFD con Pc9-T1107 fue efectiva también en un cultivo tridimensional de células de carcinoma de colon CT26. El valor de IC50 obtenido (370 nM) fue considerablemente mayor al valor previamente descripto en cultivos 2D (10 nM), indicando que en modelos más complejos se requieren mayores cantidades de FS para alcanzar el mismo efecto fototóxico. Demostramos también la inducción de un mecanismo de muerte celular apoptótico en los cultivos de esferoides de células CT26. Finalmente, decidimos evaluar la terapia en un modelo aún más complejo, como es el modelo in vivo. En el trabajo con animales se añaden las complicaciones resultantes de la posible degradación de la formulación administrada por opsonización u otros procesos, la participación del sistema inmune, la biodistribución del FS, etc. Demostramos que la TFD con Pc9-T1107 en ratones Balb/c desafiados con células CT26 produjo un enlentecimiento significativo en la progresión del crecimiento tumoral, un incremento de áreas histológicamente necróticas en el tumor y un aumento en la sobrevida de los animales tratados. El tratamiento no generó toxicidad sistémica, ni en tejidos fisiológicamente relevantes, ni particularmente a nivel hepático. Además, se demostró que, al igual que en cultivos 2D y 3D, se desencadenó un mecanismo apoptótico de muerte celular. En su conjunto, los resultados obtenidos demostraron que la TFD con Pc9-T1107 resultó un tratamiento eficaz y potente para el tratamiento del CCR tanto en modelos in vitro (bi y tridimensionales) como in vivo (ratones Balb/c). La caracterización realizada del mecanismo de muerte celular facilitará en un futuro la evaluación de terapias combinadas con otras alternativas que posibiliten potenciar la eficacia terapéutica de Pc9-T1107, entre las cuales podríamos mencionar el empleo de inhibidores de autofagia - que participa como un mecanismo de sobrevida -, el uso de moléculas que promuevan el estrés del RE, o el empleo de FSs que inicien el daño oxidativo en otra organela, como por ejemplo FSs de localización mitocondrial. 169 En conclusión, nuestros estudios nos permiten postular a la formulación Pc9-T1107 como un agente de potencial interés terapéutico que podría, en un futuro cercano, ser utilizado en ensayos clínicos dirigidos a combatir, de manera más eficiente, una de las enfermedades malignas gastrointestinales más usuales, como es el carcinoma colorrectal.