Tipificación de las especies de Lutzomyia que actúan como potenciales vectores de Leishmania spp. en la provincia de Salta.

Abstract

La leishmaniasis tegumentaria americana (LTA) es una enfermedad protozoaria causada por parásitos del género Leishmania que se transmiten a través de la picadura de flebótomos hembras. La LTA es endémica en diez provincias de Argentina, siendo el departamento de Orán la región más comprometida en la provincia de Salta (Salomón et al., 2008, Krolewiecki et al., 2017). La zona se caracteriza por la prevalencia de Leishmania (Viannia) braziliensis cuyo vector putativo es Nyssomyia neivai, la especie de flebótomos más abundante, y los reservorios se desconocen hasta el momento (Salomón et al., 2004, Marco et al., 2005).El área de estudio de esta tesis fue el departamento de Orán. A lo largo de los años 2015, 2016 y 2017 se capturaron flebótomos en siete sitios periurbanos y rurales para búsqueda de infección natural, la tipificación molecular de flebótomos y parásitos y el estudio de la abundancia estacional de las especies capturadas.Inicialmente, se analizó la variación estacional de las hembras capturadas en dos sitios periurbanos colindantes a parches de vegetación secundaria, emplazados en zonas con reporte de casos humanos de LTA. La abundancia media estacional de las hembras capturadas se analizó en forma conjunta con la variación mensual de casos de LTA diagnosticados en el Instituto de Investigaciones de Enfermedades Tropicales (IIET) durante el periodo de muestreos entomológicos de esta tesis. Así se determinó la existencia de un intervalo de tiempo de aproximadamente 90 días entre los meses de gravidez de hembras y los meses en que se registra un mayor número de casos humanos.A lo largo de esta tesis se buscó, principalmente, abordar molecularmente a los vectores potenciales de LTA que fueron capturados en sitios con riesgo de transmisión. Para esto, se normalizó y aplicó la combinación de PCR-RFLP del gen 18S ARN ribosomal (18S ARNr) para la tipificación molecular de hembras. Como resultado, las especies circulantes en los sitios de muestreo: Nyssomyia neivai, Migonemyia migonei, complejo cortelezzii y Psathyromyia shannoni pudieron ser identificadas molecularmente; siendo la combinación PCR-RFLP 18S ARNr capaz de incluso identificar ejemplares que la metodología tradicional no había podido determinar por la ruptura de estructuras de valor taxonómico o por un montaje inadecuado. Los patrones de restricción obtenidos fueron especie-específicos y fueron validados por la identificación morfológica tradicional.Por otra parte, 1.671 hembras fueron capturadas y analizadas molecularmente para la detección de ADN de Leishmania spp. Previamente, se puso a punto la PCR ADN kinetoplastídico (ADNk) para la búsqueda de material genético parasitario, con una sensibilidad de 25 promastigotes por flebótomo. Luego, esta fue combinada con PCR de Actina para que la resultante PCR dúplex ADNk-actina permita el análisis de pooles de 10 hembras. Además, para tipificar y genotipificar la especie parasitaria en flebótomos, se estandarizó la PCR del gen de proteína heat shock 70 (hsp70) y PCR de citocromo b (cyt b) con cepas de Leishmania de referencia, asilados de pacientes con LTA y aislados de perros con leishmaniosis canina previamente tipificados.Finalmente, para búsqueda tradicional de infección natural, 254 hembras fueron capturadas y diseccionadas para la observación microscópica de su contenido intestinal. Tanto las hembras analizadas por disección como aquellas analizadas molecularmente resultaron negativas para infección por Leishmania spp. lo que destaca la baja tasa de infección de los vectores de LTA y el carácter microfocal de la transmisión cuya dinámica depende principalmente de los reservorios, que se desconocen en la zona hasta el momento.

The American tegumentary leishmaniasis (ATL) is a protozoan disease caused by parasites of the genus Leishmania that are transmitted through the bite of female sandflies. The ATL is endemic in ten provinces of Argentina, being the department of Orán the most affected region in the province of Salta (Salomón et al., 2008, Krolewiecki et al., 2017). The area is characterized by the prevalence of Leishmania (Viannia) braziliensis whose putative vector is Nyssomyia neivai, the most abundant sandfly species; the reservoirs are unknown until now (Salomón et al., 2004, Marco et al., 2005). In this work, the captures of sandflies were undertaken in seven periruban and rural sites from the department of Oran in the years 2015, 2016 and 2017. Sandflies were analyzed with the purpose of searching natural infection, the molecular typing of sandflies and parasites, and to study the abundance of the species caught. The seasonal variation of sand fly females that were captured in two periurban sites adjacent to patches of secondary vegetation was analyzed together with the monthly variation of ATL cases diagnosed at Instituto de Investigaciones de Enfermedades Tropicales (IIET) since 1986. The highest number of ATL cases occurred in August, and this coincides with the peak of abundance of Ny. neivai from site 1. Instead, one of the abundance peaks of Ny. neivai from the site2 took place in June; the gap between abundance of sandflies and peak of patients, could be attributed to the incubation period of the disease and the time of evolution of the lesions that have the patients. In addition, the combination of PCR-RFLP of the 18S RNA ribosomal RNA (18S rRNA) was standardized to typify the sandflies molecularly. As a result, all the circulating species in the sampling sites: Nyssomyia neivai, Migonemyia migonei, complex cortelezzii and Psathyromyia shannoni could be identified successfully. The restriction patterns obtained were species-specific and were validated by traditional morphology. Also, the techniques were able to identify specimens that the traditional methodology could not determine due to the rupture of structures of taxonomic value. On the other hand, 1671 females were captured and analyzed molecularly for the detection of Leishmania spp DNA. Previously, a PCR based on kinetoplast DNA (DNAk) was standardized, and its sensitivity was 25 promastigotes per sand fly. Then, the PCR DNAk was combined with PCR actin, the resulting duplex PCR DNAk-actin allows the analysis of pools of 10 females. Moreover, to tipify and genotype the parasitic species in sandflies, the heat shock 70 protein gene (hsp70) and cytochrome b (cyt b) PCR were standardized with reference Leishmania strains, isolated from ATL patients and isolates from dogs with canine leishmaniosis previously typified. Finally, 254 females were captured and dissected for detecting natural infection through the microscopic observation of their guts. Both the females analyzed by dissection and those analyzed molecularly were negative for infection by Leishmania spp. which highlights the low infection rate of vectors and the microfocal character of ATL transmission whose dynamics depends mainly on the reservoirs, which are unknown in the area until now.