Comunidades microbianas asociadas al intestino de la chinche verde, Nezara viridula: Biodiversidad y función biológica

Abstract

El estudio de las interacciones entre los cultivos y los insectos plaga es de suma importancia a nivel mundial, ya que permite la generación de herramientas tecnológicas para lograr una producción agrícola sustentable sin perder rentabilidad. La soja es el principal cultivo de Argentina y el complejo de chinches es unas de las principales plagas de este cultivo, frente a la que no se tienen tecnologías alternativas a los pesticidas químicos. Los insectos plaga han logrado desarrollar mecanismos para tolerar las defensas de las plantas y, en algunos casos esta tolerancia es debida a la presencia de ciertas bacterias intestinales. A pesar de la importancia de la chinche verde como plaga de soja, se conoce muy poco sobre su flora intestinal, y las consecuencias de la presencia de estas bacterias sobre la biología de la chinche verde. En esta tesis se analizó la relación bacteria-chinche verde-soja, con el objetivo de estudiar el papel de las bacterias en el intestino de la chinche verde en la interacción planta-insecto. Para ello se caracterizó la comunidad microbiana del insecto en zonas productoras de soja y se puso a prueba la funcionalidad in vitro e in vivo. Para la caracterización de las comunidades microbianas se utilizó el análisis automático del espaciador intergénico (ARISA) y cultivos en placas, y las bacterias aisladas se identificación por secuenciación del 16S ARNr.Los resultados indican que los ventrículos (V2-V3) donde se produce la digestión de la dieta pueden presentar bacterias con una riqueza variable entre 0 y 5 especies. La frecuencia en la presencia de bacterias en el intestino medio fue del 24% y se encontró una mayor abundancia relativa de enterobacterias y enterococos, entre 103 y 106 UFC/mg de intestino, y una menor abundancia relativa de una microbiota transitoria conformada por Bacillus, Micrococcus, actinobacterias y otros, y que no superó 1000 UFC/mg intestino. Se vio que los géneros Yokenella y Enterococcus fueron los más frecuentes y la probabilidad de encontrarlos aumentó con el índice de agriculturización. Además, estos géneros estuvieron estrechamente emparentadas con los aislados en Brasil. También se confirmó la presencia de un simbionte alojado en la cloaca (V4) de la chinche verde y filogenéticamente emparentado con Erwinia. Para evaluar la funcionalidad in vitro de las bacterias aisladas del intestino medio V2-V3 de la chinche verde se utilizaron pruebas bioquímicas y medios específicos. También se realizaron ensayos de fermentación de harina de soja, para evaluar el efecto de la fermentación sobre los inhibidores de cistein proteasas que pueden afectar las enzimas digestivas de la chinche verde. Los resultados indicaron que las yokenellas no tienen la capacidad de degradar los componentes de la dieta más importantes: proteínas de reserva y sacarosa. Sólo algunas cepas pudieron degradar lípidos. Los enterococos no pudieron degradar proteínas ni lípidos, aunque sí degradaron sacarosa. De todas maneras, el proceso fermentativo redujo el poder inhibitorio de la harina de soja frente a la cistein proteasa Papaína, in vitro.Para evaluar la interacción bacteria intestinal-chinche verde se utilizaron metodologías de eliminación de las bacterias intestinales y reinfección con cepas puras. Los resultados mostraron que el índice de infección de los ventrículos V2-V3 de las ninfas de 1er estadio en cautiverio es baja, lo que indica una transferencia ineficiente de estos simbiontes desde la madre hacia la descendencia. En ensayos de reinfección se vio que Yokenella sp. NvU02 afecta negativamente el desarrollo de las ninfas en 2do estadio y 4to estadio generando un índice de mortalidad del 80% en 6 y 20 días respectivamente. Los adultos infectados con Yokenella sp NvU02 no se vieron afectados en su supervivencia, ni se ven alterados los índices de peroxidación lipídica o actividad proteolítica intestinal. Se vio además, que la ausencia del simbionte ubicado en la cloaca (v4) no afecta la supervivencia, ni el desarrollo de las ninfas que se alimentan de soja en cautiverio. Para los experimentos en los que se evaluó la interacción bacteria intestinal-chinche verde en plantas de soja los resultados indicaron que las bacterias tienen un efecto negativo sobre el desarrollo de las chinches cuando se alimentan de plantas de soja, ya que disminuyen el peso final alcanzado por las ninfas en 5to estadio. Se vio que afectan negativamente la actividad proteolítica del intestino y aumentan la peroxidación lipídica. La supervivencia de las ninfas infectadas con Yokenella sp. NvU02 sólo se vio afectada en los estadios más jóvenes. Además, cuando la chinche verde infectada con Yokenella sp NvU02 se alimenta sobre plantas de soja a campo, el insecto puede eliminar estas bacterias del intestino. Los resultados de esta tesis demuestran que las bacterias encontradas en el intestino de la chinche verde en zonas productoras de soja de Argentina, no tienen un efecto positivo sobre los insectos que facilite su alimentación de la soja. Contrariamente a lo esperado, las bacterias mostraron efectos negativos sobre las chinches, disminuyendo su supervivencia, crecimiento y desarrollo. Tanto en cautiverio como en plantas de soja, los estadios ninfales jóvenes fueron más susceptibles a la infección bacteriana, mientras que los estadios más avanzados (adultos) toleran la infección y la presencia de bacterias en el intestino medio. La presencia de bacterias en el intestino está relacionada con la diversidad de hospederos y el índice de agriculturización, por lo tanto las bacterias deben tenerse en cuenta cuando se estudia la interacción entre la chinche verde y la soja.