Bases moleculares de interacciones virus-hospedador: análisis biofísico y estructural de la interacción de la proteína E1A de Adenovirus con su blanco específico Retinoblastoma

Abstract

Virus patogénicos como Adenovirus, Papilomavirus y Poliomavirus poseen proteínas capaces de interactuar con el supresor de tumores Retinoblastoma (pRb), controlador central del ciclo celular eucariótico. Dichas interacciones se establecen en sitios utilizados por pRb para unir blancos endógenos como el surco A/B donde se une el factor de transcripción E2F y el surco LxCxE donde se unen proteínas que poseen el motivo LxCxE. Estos virus hacen mímica de motivos lineales de interacción altamente conservados, y generalmente presentes en regiones intrínsecamente desordenadas, para interferir efectivamente con la red celular y tomar el control de la célula huésped conduciendo en algunos casos a transformación celular y oncogénesis. La oncoproteína viral E1A del Adenovirus (AdE1A) es una proteína intrínsecamente desordenada (IDP) y se une a pRb a través de dos motivos lineales necesarios para desplazar a E2F, el motivo E2F y el motivo LxCxE , que se encuentran separados por una región de 70 residuos o “ linker ”. En este trabajo, sugerimos que ciertas características de esta proteína desempeñan un papel esencial en los mecanismos de desregulación de pRb. Dado el limitado conocimiento mecanístico y estructural de alta resolución con respecto a AdE1A, su interacción con pRb y la contribución de la región “ linker ” en esta interacción, nos propusimos caracterizarlos para revelar información que servirá para comprender mejor las interacciones virus-hospedador. En primer lugar, desarrollamos un protocolo de expresión recombinante de AdE1A y mutantes individuales de motivos, con rendimientos de 9 mg/L y pureza superior al 95%. Experimentos biofísicos evidenciaron que AdE1A es un monómero intrínsecamente desordenado con radio hidrodinámico extendido y migración anómala en gel. En segundo lugar, ensayos de interacción muestran que AdE1A se une a pRb con estequiometría 1:1 y una muy alta afinidad ( K D = 24 pM). Aunque los sitios individuales unen a pRb con menor afinidad (≈ K D = 110nM) que la E2F celular ( K D = 1 nM), el modelado del sistema como un arreglo de dos motivos unidos por un “ linker ” de longitud óptima y altamente flexible permite explicar la potenciación de su afinidad global y la efectividad de la proteína AdE1A en el desplazamiento de E2F. En tercer lugar, estudios estructurales de RMN permitieron la asignación completa de la cadena carbonada de AdE1A y su caracterización a nivel de estructura secundaria y propensiones conformacionales evidenciaron su naturaleza desordenada y flexible. AdE1A se une a pRb a través de dos sitios independientes conformados por residuos centrales de los motivos E2F y LxCxE modulados por residuos flanqueantes con función complementaria, más interacciones débiles en la región “ linker ”. El análisis de la región “ linker ”, sugiere que existe un fino balance entre repulsión de cargas y contactos hidrofóbicos débiles con pRb en regiones de interacción secundarias, las cuáles se encuentran altamente conservadas a nivel evolutivo y que contribuirían a su capacidad de interacción con múltiples blancos celulares. Los resultados del presente trabajo contribuyen a comprender las bases moleculares de las interacciones entre proteínas de virus y hospedador y los mecanismos mediante los cuales los virus toman control de la célula huésped, lo cual allana el camino para el desarrollo de estrategias terapéuticas contra el cáncer de etiología viral.