Fluoromicobacteriófagos para el screening rápido de alto rendimiento de drogas antituberculosas

Abstract

La Tuberculosis (TB) es una enfermedad infecciosa que constituye uno de los mayores problemas sanitarios a nivel mundial. Millones de personas contraen la enfermedad, tanto que a partir de 2015 se localizó dentro de las diez causas de muerte más probables en el mundo y la primera causa de muerte por un agente infeccioso, incluso superando el HIV. El agente causal es el bacilo Mycobacterium tuberculosis que se dispersa por vía área. El ritmo desenfrenado de crecimiento de las resistencias a los antibióticos que se emplean en el tratamiento de la enfermedad acentúa la necesidad de nuevas drogas con mecanismos de acción diferentes a los ya existentes y para esto es necesario aumentar los esfuerzos en el área de descubrimiento. Uno de los objetivos fundamentales de esta tesis fue desarrollar una metodología de evaluación de actividad de drogas in vitro novedosa, rápida y sensible que pueda aportar nuevas alternativas para el tratamiento de la TB multirresistente. Los fluoromicobacteriófagos, micobacteriófagos que acarrean genes reporteros fluorescentes en su genoma, se han vuelto una herramienta fundamental para revelar el estado metabólico de las micobacterias y, en consecuencia, su respuesta a antibióticos. Como parte de este trabajo, se han optimizado las condiciones de detección y evaluación de la actividad extracelular de drogas contra M. tuberculosis en un formato automatizado de 96 pocillos utilizando fluorimetría para la lectura de la señal luego de la infección con el fago mCherrybombɸ. Se observó un descenso en la señal fluorescente en el tiempo a medida que aumentaba la concentración de las drogas con diferentes mecanismos de acción en M.tuberculosis y pudieron determinarse exitosamente concentraciones mínimas inhibitorias (CIM) en un tiempo corto (15-32 horas).Para validar la metodología como ensayo de screening de célula entera y alto rendimiento, se evaluó la miniaturización a un formato de 384 pocillos y la respuesta ante un set de compuestos antimicobacteriales de la compañía GlaxoSmithKline (n=204), comparando los resultados obtenidos en M.tuberculosis H37Rv y M. bovis BCG. A pesar que los resultados preliminares fueron prometedores, el ensayo final en este formato presentó alta variabilidad y una relación señal fluorescente:background (S:B) desfavorable, otorgando parámetros de robustez bajos (Z?<0.4) en algunas de las placas evaluadas. El protocolo empleado incluía una pre-incubación de las drogas por 24h con la bacteria y la mayoría de los compuestos que mostraron mayor actividad fueron inhibidores de proteínas esenciales de membrana conocidas (DprE, MmpL3, QcrB, KasA). Al mismo tiempo, con la metodología mCherrybombɸ, se detectaron varios compuestos altamente activos con mecanismos de acción desconocidos que podrían ser explorados en profundidad en el futuro (GSK2428832A, GW623128X).Por otro lado, se intentó poner a punto una metodología para la evaluación de la actividad intracelular de compuestos. Para esto, se desarrolló un ensayo de infección en macrófagos humanos con M.tuberculosis en los cuales se detectó un porcentaje de la bacteria intracelular utilizando mCherrybombɸ evaluando la presencia de señal fluorescente debida a la infección por el fago. Ante al agregado de drogas activas, como Rifampicina, Isoniacida y Moxifloxacina, se observó pérdida significativa de la señal fluorescente demostrando que el fago puede revelar el estado metabólico bacteriano dentro del macrófago.Finalmente, dado el interés que suscitan actualmente las lisinas provenientes de fagos, enzimas que asisten en la lisis celular luego de le infección, se estudió la actividad de la lisina A del micobacteriófago TM4 como alternativa de antimicrobiano y potenciales enzibióticos. Aunque no pudo observarse actividad lítica en Mycobacterium smegmatis al suplementarse exógenamente, se comprobó que posee la capacidad de hidrolizar el peptidoglicano bacteriano y generar lisis celular en otros géneros bacterianos. Los resultados obtenidos aportan datos en el ámbito del descubrimiento de drogas antituberculosas y resaltan la relevancia de los fagos y en particular, de los fagos reporteros, como herramientas para la lucha contra la TB.

Tuberculosis (TB) is one of the major worldwide health problems. Since 2015, it was declared among the first ten global causes of death and the first from an infectious disease, even superior to HIV in mortality. Millions of people die from the disease every year and approximately two billion people are infected with the causative agent, Mycobacterium tuberculosis, an airborne pathogen. The accelerated growth of resistance to the regular therapeutics used to treat the disease highlights the importance of finding new drugs with different mechanisms of action and, therefore, the necessity to increase the efforts in the drug discovery field. The fundamental objective of this thesis was to develop an innovative, rapid and sensitive in vitro methodology for evaluation of drug activity that could provide new alternatives to the treatment of multi-resistant TB. Fluoromycobacteriophages, mycobacteriophages carrying reporter fluorescent genes in the genome, have become an important tool for rapid evaluation of mycobacterial metabolic state and, in consequence, their response to antibiotics. As part of this work, conditions of infection and evaluation of the extracellular activity of drugs against M. tuberculosis were optimized in an automated 96-well format after infection with the phage mCherrybombɸ using fluorimetry to capture the fluorescence readout. A decrease in the fluorescent signal was observed for increasing concentrations of known anti-TB compounds with different mechanisms of action and minimal inhibitory concentration (MIC) could be determined in a short period of time (15-32 hours). To validate the methodology for whole-cell high-throughput screening, miniaturization to a 384-well format and the response to an antimycobacterial set of compounds from GlaxoSmithKline company (n=204) was evaluated, comparing results between M. tuberculosis H37Rv and M. bovis BCG. The final assay showed high variability and an unfavorable signal to background ratio (S:B), with low performance coefficient (Z’<0.4) in some of the evaluated plates. However, inhibition results showed a correlation between mCherrybombɸ methodology and REMA for this set of compounds, indicating that our technique is promising. The experimental set up included a 24-hour pre-incubation of bacteria and drug and the majority of high-activity hits were inhibitors of known essential membrane proteins (DprE, MmpL3, QcrB, KasA). At the same time, several highly active compounds defined with mCherrybombɸ methodology could be further explored since their mechanisms of action remain unknown. In addition, the focus was turned later on to set up the methodology for evaluation of the intracellular activity of drugs. An infection assay was developed to detect a percentage of intracellular bacteria in human macrophages using mCherrybombɸ and evaluating fluorescence, due to phage infection. A significant loss of fluorescent signal was observed in the presence of different active drugs as Isoniazid and Moxifloxacin demonstrating the phage could reveal the metabolic state of intracellular mycobacteria. Finally, due to the raised interest in recent years in phage lysins, enzymes that cause bacterial lysis after phage infection, the activity of Lysin A from mycobacteriophage TM4 was studied as an alternative antimicrobial and potential enzibiotic. Even though lysis in Mycobacterium smegmatis could not be detected when added from outside, peptidoglycan lysis and cell lysis in other bacterial genera were observed. The results summarized in this work contribute to the antitubercular drug discovery field and underline the importance of phages and, in particular, reporter phages as useful tools in the global fight against TB.