Evaluación del rol de las integrinas en el proceso de diferenciación cardíaca a partir de células madre pluripotentes humanas

Abstract

Las celulas madre pluripotentes (CMP) son una herramienta clave para lograr un mayor conocimiento tanto del desarrollo embrionario como para avances científicos en el campo de la medicina regenerativa. Actualmente son utilizadas en el modelado de enfermedades, ensayos farmacológicos y en un futuro, terapias de reemplazo celular. El desarrollo de este área de investigación es posible de llevar a cabo gracias a dos propiedades de las CMP: a) Su capacidad de autorenovación y b) de diferenciaciónhacia las 3 capas germinales del embrión en desarrollo. Las CMPh se encuentran en constante interacción con proteínas presentes en la Matriz Extracelular (MEx) a través de las integrinas. Estas son una superfamilia de receptores de adhesión celular que reconocen principalmente ligandos de la MEx y de la supercie celular. El objetivo de esta tesis consiste en evaluar la relevancia que poseen determinadasintegrinas en los diferentes estadios celulares que surgen durante la diferenciación cardíaca a partir de una línea de células madre embrionaria humanas (CMEh). Desarrollamos dos modelos de diferenciación cardíaca distintos con el objetivo de obtener, en cada uno de ellos, las múltiples poblaciones mesodérmicas que se originan durante la especicación (progenitor mesodérmico, progenitor cardíaco y cardiomiocitos inmaduro) y caracterizar su dinámica de aparición mediante la presencia de marcadores moleculares. En segundo lugar, analizamos el perfil de expresión de diferentes subunidades de integrinas en los estadios celulares antes mencionados. En este casose observaron cambios en los niveles de expresión de las integrinas en las diferentes poblaciones celulares durante la diferenciación cardíaca. Por último, evaluamos el rol de la integrina a5 mediante la manipulación de su expresión en la diferenciación cardíaca. Para esto, establecimos una línea de silenciamiento inducible en nuestra línea de CMEh mediante el uso de una variante del sistema CrispR-Cas9. El silenciamientode la integrina a5 en el estadio inicial de la diferenciación afectó la dinámica de aparición del progenitor mesodérmico lo cual derivó en una menor eficiencia de obtención de celulas cardíacas.Nuestros resultados sugieren que la presencia o ausencia de las distintas integrinas contribuye a la diferenciación específica, primero hacia linaje mesodérmico y finalmente a cardiomiocitos mediante la regulación diferencial de la expresión de las diferentes subunidades de integrinas.

Pluripotent stem cells provide an invaluable tool for studying embryonic development and also, for regenerative medicine: disease modeling, drug screening, and prospectively, cell-replacement therapies. PSC are capable of unlimited undifferentiated proliferation in vitro and the ability to differentiate into the three embryonic germ layers. Stem cells and ECM have a close multifunctional relationship. The engagement of stem cells with their surrounding extracellular matrix (ECM) through integrins act as a crucial control mechanism of stem cell function. Integrins are a superfamily of adhesion molecules, are non-covalently-associated α/β heterodimers that mediate cell–cell, cell–extracellular matrix interactions by binding to distinct ligands. In this thesis, the main goal was to study how important are specific integrins in different multipotent mesoderm-committed populations during cardiac differentiation from human embryonic stem cells (hESC). First, we developed two different protocols of cardiac differentiation in order to identify different mesoderm populations through the presence of typical molecular markers of each stage (mesodermal progenitor, cardiac progenitor and cardiomyocytes). Then, we characterized in depth the levels of integrins expression in cell populations described before. We show a different regulation of integrins expression in mesoderm-committed populations, suggesting that are relevant to get an efficient cardiac specification. Finally, we assessed the role of integrin α5 by manipulating transcription in cardiac differentiation. We generated an inducible hESC line through a variant of crisprcas9 system where we are able to repress the expression of this integrin subunit. Knockdown of integrin α5 during first stage of mesoderm commitment altered the generation of the mesodermal progenitor and this led to a lower efficiency of cardiac differentiation protocol. Our results indicate that the presence or absence of specific integrins contribute to specific differentiation, first to mesoderm commitment and then to cardiomyocytes through a differential regulation of integrin expression.