Generación de nanopartículas de quitosano empleando micelas inversas como nanomolde y su evaluación como agente antimicrobiano e inmunoestimulante en glándula mamaria bovina

Abstract

La mastitis bovina (MB) es una inflamación de la glándula mamaria (GM) producida como respuesta al ingreso de microorganismos a través del canal del pezón. Esta enfermedad genera grandes pérdidas económicas a la actividad lechera nacional y mundial. Su tratamiento consiste en el uso de antibióticos, sin embargo, estos no pueden eliminar por completo la infección debido a que se genera resistencia a los mismos. Además, los patógenos desarrollan mecanismos de supervivencia tales como la formación de biofilm y la sobrevida a nivel intracelular en las células bovinas, evadiendo las terapias antibióticas y la respuesta inmune del huésped. Por lo tanto, se necesitan nuevas terapias que permitan disminuir el uso de antibióticos y que actúen como inmunoestimulante para superar los mecanismos de evasión que desarrollan los patógenos. Las nanopartículas (NPs) han atraído recientemente mucha atención como agentes antimicrobianos. El quitosano (Q) es un polisacárido no tóxico, biocompatible, y con actividad antibacteriana. Por lo tanto, en este trabajo, se propuso obtener nanopartículas de quitosano (NPs-Q) y evaluar el potencial de dicha formulación para el tratamiento de la MB. El empleo de micelas inversas (MIs) como nanoreactores ofrece una vía sintética que permite obtener NPs de tamaño controlado. Sin embargo, es una metodología de síntesis muy poco explorada en la obtención de NPs-Q. En este trabajo se propuso llevar a cabo el entrecruzamiento de Q con glutaraldehído (G) empleando dos nanoreactores micelares marcadamente diferentes: benceno/cloruro de bencil-hexadecil-dimetilamonio (BHDC)/H2O y n-heptano/ bis-(2-etilhexil) sulfosuccinato de sodio (AOT)/H2O. Además, se planteó evaluar la actividad antimicrobiana de las NPs-Q frente a bacterias del género Staphylococcus aislados de casos de MB y su actividad inmunoestimulante en células epiteliales de GM bovina. En este trabajo de tesis fue posible poner a punto una metodología de síntesis de NPs-Q empleando distintas MIs como nanoreactores. Las MIs permitieron obtener NPs de dimensiones nanométricas y con baja polidispersidad. Además, fue posible controlar el tamaño final de las partículas variando la concentración de reactivos, concentración de G y contenido acuoso del nanoreactor. Además, se demostró que las propiedades interfaciales de las MIs influyen en la reacción de Q con G, siendo más efectivo el entrecruzamiento en MIs de n-heptano/AOT/H2O. Por otro lado, se evaluó la actividad antimicrobiana de NPs-Q de diferentes tamaños obtenidas en distintas MIs, encontrando que, indistintamente del sistema empleado como nanoreactor, la actividad antimicrobiana es mayor mientras menor es el diámetro de partícula. Las NPs-Q que mostraron mejor potencial fueron evaluadas como agente antimicrobiano y antibiofilm frente a diez aislamientos del género Staphylococcus empleando diversas técnicas. Las NPs-Q desarrolladas presentaron efecto bactericida frente a todas las cepas evaluadas, exhibiendo mejor efecto que el polímero Q. Además, NPs-Q inhibieron la formación de biofilm de cepas y redujeron el número de bacterias internalizadas en células epiteliales de GM bovina, demostrando bloquear los dos principales mecanismos de supervivencia desarrollado por los patógenos. El tratamiento de biofilms preformados con NPs-Q fue capaz de erradicar los biofilms bacterianos luego de 48 h de tratamiento. Las NPs-Q no mostraron toxicidad en células bovinas. Si bien no exhibieron capacidad de estimular la producción de citoquinas pro-inflamatorias y anti-inflamatorias en células epiteliales de GM bovina, se encontró que son capaces de actuar como nanotransportadores, lo que permite cargarlas con algún compuesto que presenten esta propiedad. Todos los resultados obtenidos en este trabajo demuestran el gran potencial de NPs-Q obtenidas en MIs para ser empleadas en el tratamiento de la MB.

Bovine mastitis (BM) is an inflammatory response to the microbial colonization of mammary gland and is responsible for major economic losses on dairy farms worldwide. Currently, BM treatment consists of antibiotic therapies. However, antibiotics usually cannot eradicate completely the infection due of acquired drug resistance and survival mechanisms of bacteria such as biofilm formation and the ability of bacterial pathogens to attach to and enter epithelial cells enables them to evade host defenses and antibiotic therapy. So new therapeutic strategies are needed to decrease or replace the use of antibiotics. Nanoparticles have recently attracted much attention as antimicrobial agents, proposed as a promising strategy to combat antimicrobial resistance and biofilm formation. Chitosan (Ch) is a polysaccharide with low toxicity, biocompatibility, biodegradability and antibacterial activity. The aim of this work wasevaluate the potential of chitosan nanoparticles (Ch-NPs) obtained by the reverse micellar methodas therapeutic agent to BM treatment. In this work Ch-NPs with different and controlled sizes were successfully prepared by cross-linking reaction of glutaraldehyde (G) and Ch inside of n-heptane/sodium bis-2-ethylhexylsulfosuccinate (AOT)/water and benzene/benzylhexadecyldimethylammonium chloride (BHDC)/ water reverse micelles (RMs). Highly monodisperse NPs were synthesized and the particle size was dependent on the reactants concentration, G concentration and the amount of water inside of the RMs used asnanoreactors. Also, reverse micellar interface affected cross-linking reaction of G and Ch, showing more efficiency inside AOT RMs. These facts were explained with the correlation of theoretical and experimental results. Ch-NPs obtained from different RMsshowed a size-dependent antimicrobial activity against BM pathogens. Additionally, we found that the nanoformulation developed presents antimicrobial activity in a dose-dependent manner. Moreover, different experiments corroborated that the antimicrobial effectiveness of Ch-NP was greater than that shown by the native polymer used in the preparation of these nanocomposites. Ch-NPs inhibited bacterial biofilm formation and reduced S. aureusinternalization into bovine mammary epithelial cell affecting the survival mechanisms of pathogens. In addition, there were not toxic for bovine cells. An incubation for 48h with Ch-NPs eradicated preformed Staphylococcusbiofilms. In despite of their excellent antimicrobial efficiency, Ch-NPs did not show to promote pro-inflammatory and anti-inflammatory cytokines production by mammary epithelial cells. Nevertheless, Ch-NPs showed the ability to entrap hydrophobic molecules inside them, which allows encapsulate an inmmunostimulant compound to developed an improved therapy. All findings exposed demonstrate the great potential of Ch-NPs synthesized by the reverse micellar method as therapeutic agent for BM treatment.