Análisis genómico y funcional del efecto de la luz sobre el crecimiento, desarrollo y capacidad PGPR de Azospirillum brasilense Az39, la cepa más utilizada en la formulación de inoculantes para no-leguminosas en la República Argentina

Abstract

La luz es un factor ambiental necesario para el crecimiento de muchos organismos, principalmente aquellos fotosintéticos. Luego del descubrimiento de proteínas receptoras de luz en bacterias no fotosintéticas, surgió la incógnita acerca de la función que desempeñan estas proteínas en el metabolismo y estilo de vida de éste grupo de bacterias. Nuestra hipótesis de trabajo se basó en que la luz modifica el crecimiento y desarrollo de Azospirillum brasilense Az39, una de las cepas más utilizadas para la formulación de inoculantes en Argentina. Para validar esta hipótesis, se propuso, realizar un análisis genotípico y funcional del efecto de la luz en ésta bacteria. Inicialmente, se analizó el genoma de Az39 para la búsqueda de secuencias relacionadas con la respuesta bacteriana a la luz. En una segunda etapa de trabajo y en condiciones de cultivo in vitro la bacteria se cultivó en medio sólido, semi-solido y líquido y expuesta a luz blanca 75W (LB), azul PAR38 (LA), roja PAR38 (LR) o mantenida en condiciones de oscuridad (O); para el caso del medio sólido, a temperaturas variables (28-36°C), diferentes distancias desde la fuente lumínica (10,18,24 y 28 cm) o intensidades, tiempos de exposición (2,4,8,12 y 24 h), medios de cultivo complejo (LB) y mínimo (MMAB).En el caso del medio semi-sólido se evaluó la movilidad (swimming) y en el caso del medio líquido la producción de biomasa (DO595 nm), el número de células (ufc.ml-1), la producción de ácido indol-3-acético (AIA), el porcentaje de agregación celular (%PA), la formación de biolfilms (DO560 nm) y la síntesis de exopolisacáridos (EPS). De manera complementaria, se realizó un análisis transcriptómico, mediante CLC de la bacteria expuesta a las diferentes condiciones de luz o mantenida en oscuridad y por último se correlacionó las respuestas de la bacteria a la exposición a diferentes luces a nivel del comportamiento de plántulas de Arabidopsis thaliana inoculadas. Nuestros resultados indican que Az39 contiene en su genoma 2 secuencias para la síntesis de proteínas del tipo fitocromo y una bacteriofitocromo Hemo-oxigenasa. En cultivo sólido, la exposición a LB y LA fue letal para el crecimiento de Az39, no así a la LR (similar al control); en medio nutricionalmente complejo, la bacteria fue menos tolerante a LB y LA mientras que a 28°C no creció en éste medio, ni tampoco en medio mínimo. A una distancia de la fuente de 10 y 18 cm, la bacteria no creció y 24 h de exposición a LB resultaron letales para la bacteria. En medio líquido, el crecimiento no resultó letal como en el medio sólido y la producción de AIA fue superior en LB en medio complejo. El %PA y la formación de biofilms, fue superior en LA, aunque aquí se observó la menor concentración de EPS. A nivel transcriptómico, la mayoría de genes que se sobre-expresaron por exposición a LB, estaban involucrados con procesos de división celular, estrés por calor o frío, quórum sensing y quenching, biosíntesis flagelar, etc.. La bacetriofitocromo hemo-oxigenasa, se indujo y el gen ipdc se reprimió, ambos en presencia de las 3 luces. Por último, a nivel in planta, se comprobó que concentraciones similares a 1.108 ufc.ml-1 de Az39 o 10 µg.ml-1de AIA, inducen un acortamiento de la raíz principal e incremento del número de raíces laterales en A. thaliana. Por otro lado, concentraciones cercanas a 20 µg.ml-1 disminuyen el último parámetro. El crecimiento y desarrollo de Az39 es afectado por LB y particularmente por LA y dicho comportamiento depende de las condiciones de cultivo a las que la bacteria es expuesta.

Light is an environmental factor necessary for some organisms growth, mainly photosynthetic ones. After the discovery of light receptor proteins in non-photosynthetic bacteria, the question arose about the function that they play these proteins in the metabolism and lifestyle of this group of bacteria. Our hypothesis was that light modifies the growth and development of Azospirillum brasilenseAz39, one of the most used strains for the inoculants formulation in Argentina. To test this hypothesis, genotypic and functional analysis of the light effect on this bacterium was proposed. Initially, the Az39 genome was analyzed for the search of sequences related to the bacterial response to light. A second stage was under in vitro culture conditions. Az39 wascultured in solid, semi-solid and liquid medium. In each case, cultures wereexposed to white light 75W (LB), blue PAR38 (LA), red PAR38 (LR) or maintained in dark conditions (O). Two different solid medium were tested: a complex media (LB) and minimum (MMAB). These culture were incubated at variable temperatures (28-36 ° C), different distances from the light source (10, 18, 24 and 28 cm), exposure times (2, 4, 8, 12 and 24 h). In semi solid condition, mobility (swimming) was evaluated. While, in liquid medium different parameters were tested: biomass production (OD595 nm), number of cells (ufc.ml-1), indole-3-acetic acid (IAA) production, percentage of cellular aggregation (%PA), biolfilms formation (OD560nm) and synthesis of exopolysaccharides (EPS). Additionally, a transcriptomic analysis was carried out, using CLC, in this experiment Az39 was exposed to different light conditions or kept in darkness. Finally, bacteria responses to exposure to different lights were correlated with inoculated Arabidopsis thalianaseedlings behavior. Our results indicate that Az39 contains in its genome 2 sequences for synthesis of phytochrome type proteins and a bacteriophytochrome Hemo-oxygenase. In solid culture, the exposure to LB and LA was lethal for the growth of Az39, not to the LR (similar to the control). In a nutritionally complex medium, Az39 were less tolerant to LB and LA, whereas at 28 °C they did not grow in this medium, this did not happenin minimum medium. Moreover, when distance from the source was 10 and18 cm, this bacterium did not grow and 24 h of exposure to LB were lethal. In liquid medium, the growth was not lethal as in the solid medium and AIA production was higher in LB in complex medium. Besides %PA and biofilms formation was higher in LA. Although lower EPS concentration was observed here. At transcriptomic level, the majority of genes that were overexpressed by exposure to LB were involved with cell division processes, heat stress or cold, quorum sensing and quenching, flagellar biosynthesis, etc. Bacetriofitochrome hemo-oxygenase, induced and the ipdcgene was repressed, both in the presence of the 3 lights. Finally, at the plant level, it was found that concentrations similar to 1.108cfu.ml-1of Az39 or 10 μg.ml-1of IAA induce shortening of the main root and increase in the number of lateral roots in A. thaliana. On the other hand, concentrations close to 20 μg.ml-1decrease the last parameter. The growth and development of Az39 is affected by LB and particularly by LA and said behavior depends on the culture conditions to which the bacterium is exposed.