Estudio de la relación funcional entre el tráfico intracelular de LRP1 y la respuesta celular a la insulina

Abstract

El LRP1 (low density lipoprotein receptor-related protein 1) es un receptor que se encuentra expresado en diferentes tipos celulares tales como células gliales de Müller y cardiomiocitos. Entre las diversas funciones de este receptor se destaca su capacidad de regular la expresión y actividad de diferentes proteínas en la membrana plasmática, como ser el caso del receptor de insulina (IR). Se ha demostrado que la deficiencia de LRP1 en neuronas y hepatocitos genera resistencia a la insulina. En este sentido, la insulina estimula el tráfico de LRP1 a la superficie celular en adipocitos, hepatocitos y células musculares, aunque se desconoce cómo es la regulación de este tráfico intracelular. Esta movilización de LRP1 hacia la membrana plasmática, a su vez, le permitiría regular la actividad del IR en respuesta a la hormona.Numerosos estudios relacionan la resistencia a la insulina con el incremento de subfracciones aterogénicas de lipoproteínas de baja densidad, como las modificadas por agregación (agLDL). El exceso de estas lipoproteínas es almacenado en diferentes tejidos, como músculo e hígado, contribuyendo con la resistencia a la insulina, aunque el mecanismo a través del cual esto ocurre no es del todo claro. El LRP1 es uno de los receptores involucrados en la captación de colesterol esterificado desde agLDL, lo que podría tener relación con alteración de la respuesta a la insulina.Teniendo en cuenta estos antecedentes, el objetivo del presente trabajo de tesis fue caracterizar la relación funcional entre el tráfico intracelular de LRP1 y la respuesta celular a la insulina. Dentro de este marco general se plantearon los siguientes objetivos específicos: i) Identificar las estructuras vesiculares de almacenamiento de LRP1, así como las proteínas de transporte vesicular y las vías de señalización intracelulares implicadas en el tráfico hacia la membrana plasmatica de este receptor por acción de insulina; y ii) Establecer la participación de LRP1 sobre la respuesta celular a insulina, y cómo este evento es alterado por la presencia de ligandos como las agLDL.Como modelo experimental se utilizaron las líneas celulares: MIO-M1, células gliales de Müller de retinas humanas; y HL-1, cardiomiocitos de ratón. En cuanto al tráfico intracelular de LRP1 inducido por insulina en células MIO-M1, por microscopia confocal se evidenció un incremento significativo de la localización de LRP1 principalmente en endosomas tempranos [EEA1+] y en el compartimento de reciclado rápido [Rab4+] en presencia de insulina. Mediante ensayos de biotinilación de proteínas de superficie celular, se evidenció que insulina promueve la movilización de LRP1 hacia la membrana plasmática en estas células. Este tráfico de LRP1 hacia la membrana plasmática fue mediado por la activación de la vía de señalización intracelular IR/PI3K/Akt, evidenciado mediante ensayos de In- cell Elisa. Por microscopia electrónica de trasmisión se pudo identificar vesículas intracelulares de ≈100 nm, que almacenan LRP1 junto con otras proteínas características de estas estructuras como sortilin y VAMP2. Finalmente, insulina promovió el tráfico de LRP1 a la superficie celular a través diferentes vías posibles de reciclado y/o exocitosis, entre ellas, la vía de reciclado rápido [Rab4+] y la vía exocítica mediada por Rab8A y Rab10, como se pudo observar mediante ensayos de biotinilacion de proteínas de superficie celular.En cuanto a la participación de LRP1 sobre la respuesta celular a insulina, y como este evento es afectado por las agLDL en células HL-1, se demostró que el tratamiento con agLDL durante 8 horas produjo una acumulación significativa de colesterol esterificado evidenciada por extracción lipídica y cromatografía en capa delgada. La captación de estas lipoproteínas modificadas fue mediada por LRP1, ya que este efecto fue bloqueado por GST-RAP. Mediante microscopia confocal se evidenció que la interacción entre las agLDL y LRP1 promovió la localización del receptor en compartimentos de degradación del tipo endosomas tardíos o lisosomas, los cuales resultaron ser disfuncionales, y afectó la localización de este receptor en regiones celulares ricas en caveolina por acción de insulina. Mediante ensayos de inmunoprecipitación, se evidenció la alteración de la asociación molecular entre LRP1 e IR. A continuación, mediante Western blot, ensayos de marcación de proteínas de superficie con biotina y microscopia confocal, encontramos que las agLDL afectaron la activación de la cascada de señalización intracelular inducida por insulina lo que resultó en una reducción de la exocitosis hacia la membrana plasmática de GLUT4 y una menor captación de glucosa por acción de insulina en los cardiomiocitos expuestos a agLDL.En conclusión, la insulina regularía el tráfico de LRP1 hacia la membrana plasmática, principalmente desde vesículas intracelulares, a través de la activación de la cascada de señalización intracelular IR/PI3K/Akt, y en parte mediante una ruta de exocitosis regulada por insulina que involucraría la participación de Rab8A y Rab10. Este evento resulta en un aumento de la expresión de LRP1 en la superficie celular, lo cual tendría implicancias en la respuesta celular a la insulina. La presencia de un ligando específico de LRP1 como agLDL alteraría la distribución intracelular de este receptor, afectando la asociación molecular entre LRP1 e IR, la señalización intracelular inducida por insulina y la captación de glucosa extracelular en cardiomiocitos. Estos resultados en su conjunto presentan una nueva perspectiva en el estudio bioquímico y celular de la relación del tráfico intracelular de LRP1 y la respuesta celular a la insulina, lo que podría tener implicancias fisiopatológicas en los procesos de neovascularización y neurodegeneración retinal como así también en la alteración de la función cardíaca que se producen en situaciones de resistencia a la insulina.

LRP1 (low density lipoprotein receptor-related protein 1) is a receptor expressed in different cell typessuch as Müller glial cells and cardiomyocytes. LRP1 can regulate the expression and activity of different membrane proteins in the cell surface, such as the insulin receptor(IR). It has been shown that LRP1 deficiency in neurons and hepatocytes generates insulin resistance. In this way, insulin stimulates the LRP1 translocation to the cell surface in adipocytes, hepatocytes and muscle cells, although the regulation of this intracellular traffic is unknown. This mobilization of LRP1 towards the plasma membrane, in turn, would allow it to regulate IR activity in response to the hormone, which could have pathophysiological implications in the retinal neovascularization and retinal neurodegeneration as well as in the alteration of cardiac function that occur in insulin resistance.Several studies have linked insulin resistance with atherogenic subfractions of low density lipoproteins, such as those modified by aggregation (agLDL). The excess of these lipoproteins is stored in different tissues, such as muscle and liver, contributing to the resistance to insulin, although the mechanism through which this occurs is not clear. LRP1 is one of the receptors involved in the uptake of esterified cholesterol from agLDL, which could be related to impaired insulin response. Taking this background into account, the principal aim of this Ph.D. thesis was to characterize the functional relationship between the intracellular trafficking of LRP1 and the cellular responseto insulin. Within this general framework, the following specific aims will be considered: i) identify vesicular storage structures of LRP1, as well as vesicular transport proteins and intracellular signaling pathways involved in insulin-induced traffic of this receptor; and ii) to establish the participation of LRP1 on the cellular response to insulin, and how this event is altered by the presence of ligands such as agLDL. As experimental model, cell lines were used: MIO-M1, Müller glial cells from human retinas; and HL-1, mouse cardiomyocytes. Regarding insulin-induced intracellular traffic of LRP1 in MIO-M1 cells, by confocal microscopy we showed a 13 significant increase in the localization of LRP1 mainly in early endosomes [EEA1 +] and in the recycling compartment [Rab4 +] in the presence of insulin, with respect to non-stimulated conditions. By biotinylation assays of cell surface proteins, it was evidenced that insulin promotes the LRP1 translocation towards the plasma membrane in these cells.This trafficking was mediated by the activation of the IR / PI3K / Akt intracellular signaling pathway, evidenced by cell surface proteins detection assays.Transmission electron microscopy characterized intracellular vesicles of ≈100 nm, which store LRP1 together with other proteins such as sortilin and VAMP2.Finally, insulin promoted the LRP1translocation to the cell surface through two different possible pathways, including Rab4-dependent endocytic recycling pathway and Rab8A and Rab10 mediated exocytic route. Regarding the participation of LRP1 on the cellular response to insulin, and as this event is affected byagLDL in HL-1 cells, it was demonstrated that the treatment with agLDL for 8 hours produced a significant accumulation of esterified cholesterol evidenced by lipid extraction and thin layer chromatography, without the formation of lipid droplet in these cells. The uptake of these modified lipoproteins was mediated by LRP1, since this effect was blocked by GST-RAP.Confocal microscopy showed that agLDL promoted LRP1 localization of this receptor in degradation compartments of the late endosome or lysosome, whichturned out to be dysfunctional. Moreover, agLDL also affected the LRP1 locationin caveolin-rich cellular regions by insulin action. Through immuno precipitation assays, alteration of the molecular association between LRP1 and IR was found. Then, by Western blot, cell surface protein biotin-labeling assay and confocal microscopy, we found that agLDL affected the activation of the insulin-induced intracellular signaling pathway, which resulted in a reduction of exocytosis towards the plasma membrane of GLUT4 and a lower glucose uptake by insulin action in cardiomyocytes exposed to agLDL. In conclusion, insulin migth regulate the LRP1 trafficking to the plasma membrane, mediated by the IR/PI3K/Akt activation and Rab8A/Rab10-dependent exocytosis.The presence of a specific ligand of LRP1 as agLDL could alter the intracellular distribution of this receptor, affecting the molecular association between LRP1 and 14IR, the insulin-induced intracellular signaling and the extracellular glucose uptake in cardiomyocytes. These results present a new perspective in the biochemical and cellular study of the relationship of the intracellular traffic of LRP1 and the cellular response to insulin, which may be an important contribution in the research for new therapeutic targets for the treatment of diabetic retinopathy and cardiomyopathy.