Caracterización de una cepa de Lecanicillium sp. LY 72.14 aislada de la ecorregión de Las Yungas tucumanas y de su potencial para producir antimicrobianos y/u otras actividades de interés biotecnológico

Abstract

Actualmente, dentro de las industrias basadas en la biotecnología están ocurriendo profundos cambios en el desarrollo de las estrategias de búsqueda para la obtención de bioproductos y descubrimiento de nuevas drogas. Una alternativa que ha ganado especial atención es la búsqueda de metabolitos de importancia biotecnológica a partir de muestras ambientales con características particulares, de acuerdo al compuesto de interés. La ecorregión de las Yungas tucumanas constituye un ambiente sub-explorado y amenazado que aloja una enorme biodiversidad microbiana, constituyendo un ecosistema ideal para la bioprospección de metabolitos fúngicos de importancia biotecnológica, como por ejemplo, compuestos antimicrobianos, exopolisacáridos (EPS), biopesticidas, entre otros.Este trabajo, se centró en la caracterización de la cepa fúngica LY 72.14 aislada de la ecorregión de las Yungas y en su capacidad para producir compuestos antimicrobianos u otras actividades de relevancia biotecnológica, como ser biopesticida y/o producción de biopolímeros. Luego de análisis morfológicos y moleculares, se constató que el aislamiento LY 72.14 se encuentra filogenéticamente relacionado a miembros del género Lecanicillium; siendo L. muscarium el más cercano.Mediante un diseño factorial completo se lograron optimizar las concentraciones de los componentes del medio de cultivo. En cultivos en lote en biorreactores a escala laboratorio, se alcanzaron niveles de producción de actividad antimicrobiana de 800 UA mL-1. El compuesto con actividad antimicrobiana se aisló y purificó 580 veces a partir del caldo de cultivo mediante un protocolo que incluyó la precipitación en frío con etanol absoluto, seguido de cromatografía de exclusión molecular. La muestra purificada fue secuenciada mediante un análisis de LC-MS/MS. Los resultados mostraron elevados porcentajes de identidad del antimicrobiano con una β 1,3-glucanasa producida por un hongo del género Lecanicillium (A0A168F128).La actividad antimicrobiana inhibió bacterias Gram-negativas y Gram-positivas a baja concentración inhibitoria mínima (CIM), mostrando efecto bactericida. El antimicrobiano posee alto peso molecular, termo-estabilidad moderada y resistencia en un amplio rango de pH, condiciones salinas, presencia de agentes quelantes y condiciones gastrointestinales simuladas.Al evaluar la capacidad de infección de L. muscarium LY 72.14 sobre la especie-plaga de frutas Anastrepha fraterculus se pudo plantear su potencial uso como biopesticida. Se observó colonización fúngica sobre el agente plaga en los 3 estados estudiados: larva, pupa y adulto, siendo el estado adulto el que presentó mayor porcentaje de muerte por infección.Finalmente se ensayó la capacidad de la cepa LY 72.14 para producir EPS en diferentes medios de cultivo. Se optimizaron las condiciones de producción y purificación y seguidamente se caracterizó el EPS, el cual exhibió una composición porcentual de un 88% de azúcares totales, con una composición de monosacáridos basada en galactosa, manosa y glucosa y una masa molecular relativa de 16,5 KDa.En base a los resultados expuestos, quedó demostrado que L. muscarium LY. 72.14 aislado de la ecorregión de Las Yungas tucumanas, es capaz de producir compuestos con potente actividad antimicrobiana, biopesticida y EPS, los que podrían ser aplicados a nivel industrial para producir insumos biotecnológicos de alto valor agregado.Palabras claves: Antimicrobianos, Biopesticida, EPS

Nowadays, relevant changes are occurring among biotechnology-based industries, particularly concerning the development of searching strategies in order to attain either highly demanded bioproducts or discovering new drugs. An alternative that gained especial attention is the straight search for biotechnologically relevant metabolites from environmental samples with particular features, frequently associated to the compound of interest. The ecoregion of “Yungas tucumanas” constitutes a sub-explored and threatened environment that hosts an enormous microbial biodiversity, thus representing an ideal ecosystem for bioprospecting fungal metabolites and activities of biotechnological relevance, such as antimicrobial compounds, exopolysaccharides (EPS), and enzymes, among others. The main objective of this work was the characterization of the fungal strain LY 72.14, isolated from the Yungas ecoregion, as well as its capacity to produce antimicrobial compounds or other activities with biotechnological significance, e.g. biopesticide and/or the production of biopolymers. Molecular fingerprinting and morphological analyses allowed assigning LY 72.14 as phylogenetically related to members of the Lecanicilium genus, being closest to L. muscarium species. By means of a complete factorial design it was possible to optimize the concentration of components of the selected culture medium. In batch cultures at lab-scale bioreactors, the production levels of antimicrobial activity reached values around 800 AU mL-1. The compound with antimicrobial activity was isolated from culture broth and 580-fold purified through a protocol that included cold precipitation with absolute ethanol followed by size-exclusion molecular chromatography. For the antimicrobial identification, the purified sample was sequenced by an LC-MS/MS analysis. Results showed high antimicrobial identity with a β-1,3-glucanase belonging to the genus Lecanicillium (A0A168F128). The antimicrobial activity inhibited Gram-negative and Gram-positive bacteria at a low minimum inhibitory concentration (MIC), displaying a bactericidal effect. The antimicrobial possesses high molecular weight, moderate thermo-stability and resistance to a broad pH range, saline conditions, presence of chelating agents and simulated gastrointestinal conditions.